巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium1301的转座诱变

本研究通过原生质体法、电击法和转座诱导方法,建立了携带转座子Tn917的质粒pTV1对野生巨大芽孢杆菌B1301菌株的转化体系与转座子突变技术,获得1000多个转座插入突变子.通过细胞分裂素生物测试法对这些突变子进行测定,筛选到2个突变子B1301-6与B1301-22.B1301-22突变子分泌的细胞分裂素比B1301有显著提高,而B1301-6突变子分必和细胞分裂比1301有显著降低.抑菌试验结果表明这2个细胞分裂素产量发生改变的突变子抑制率显著低于野生菌株,说明转座子Tn917的插入不仅使野生B1301菌株编码控制细胞分裂素产量的基因发生了改变,同时也改变了与编码抑菌功能相关的基因也受到了影响.     

玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库的构建

构建玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库,以期获得丢失玉米赤霉烯酮降解功能的突变子,克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因,阐明MQ01降解玉米赤霉烯酮的分子机制。将携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01中,50℃高温条件下,把穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株MQ01基因组中,获得转座子插入突变的阳性克隆,构建MQ01菌株的突变体文库,随机挑选突变子采用PCR和Southern杂交方法进行验证。本研究成功获得了3 000多个TnYLB-1转座子插入突变的阳性克隆,构建了B.amyloliquefaciens MQ01的突变子文库,结果显示TnYLB-1转座子以单拷贝的形式随机插入到B.amyloliquefaciens MQ01的基因组DNA中,从而可以从转座子突变文库中筛选丢失玉米赤霉烯酮降解功能的转座突变子,从菌株MQ01中克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因。     

Establishment of Real-Time Ouantitative PCR Method for Determination of Transposon Copy Number in Cronobacter sakazakii

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法.[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值.[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝.[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测.     

阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数实时定量PCR检测方法的建立

[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法。[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值。[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝。[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测。     

牛源大肠杆菌对喹诺酮类抗生素耐药相关基因的筛选及鉴定

为在大肠杆菌全基因组范围内筛选和鉴定与喹诺酮类抗生素耐药性相关的基因,通过对临床分离的13株大肠杆菌进行药敏试验,选择耐药谱较广泛的菌株作为研究对象,利用Mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,并以亲本菌株为对照筛选文库中对喹诺酮类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变株中转座子的插入位点及其破坏的基因。结果表明:从突变株文库中筛选得到22株分别对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸敏感的突变株,其中7株对4种抗生素都敏感;插入位点分析发现,抗生素敏感突变株中被转座子破坏的基因包括ecs4206(磷酸核酮糖激酶)、ecs3959(β-D-半乳糖苷酶β亚基)、ecs3946(假定蛋白)和ecs1857(DNA结合转录调控因子)。筛选出的基因可被开发为控制或扭转大肠杆菌耐药性的作用靶点。     

鸡源沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药相关基因的筛选及鉴定

[目的]从沙门氏菌全基因组范围筛选和鉴定其与β-内酰胺类抗生素耐药性相关的基因.[方法]对临床分离的10株沙门氏菌进行药敏试验,选择耐药性最广泛的菌株作为研究对象,利用mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,筛选文库中对β-内酰胺类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因.[结果]从突变株文库中筛选得到15株分别对青霉素G、氨苄西林和头孢哌酮敏感的突变株,其中3株对三种抗生素都敏感.转座子破坏基因为STM4216 (inner membrane protein)和STM4150 (50S ribosomal protein L1).[结论]筛选出的基因有望成为控制或扭转沙门氏菌耐药性的作用靶点.     

谷子、水稻与其野生种基因组转座子比较

为探究转座子(Transposable elements, TEs)在谷子、水稻驯化过程中的变异,选取谷子(Setaria italica)、狗尾草(Setaria viridis)、栽培稻(Oryza sativa japonica,Oryza sativa indica)、野生稻(Oryza rufipogon,Oryza nivara)的基因组进行转座子注释,统计分析各类转座子在基因组中的插入数及位置,对调控落粒、分蘖、抽穗期和株高等驯化相关基因进行相似性比对。结果表明：在‘晋谷21’突变体(xiaomi)基因组中插入的转座子数目比狗尾草中多4 865个,‘豫谷1号’基因组中插入的转座子数目比狗尾草中少6 286个,而水稻栽培种基因组中转座子数目及所占比例仅为野生种的1/2。在落粒、米色等驯化相关基因中转座子插入在数目及位置上都存在差异,在谷子落粒基因中,谷子基因存在转座子插入,而狗尾草基因中不存在;在谷子米色相关基因中,狗尾草基因中存在转座子插入,谷子基因中不存在。转座子介导驯化相关基因功能变异,历经较长时间的农业生产将适合栽培的农艺性状稳定了下来。     

降解布洛芬克隆菌株转座子插入突变体的构建

【目的】敲除布洛芬福斯质粒文库克隆菌株4F6中的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因(C23O),构建其Tn5插入突变体,为布洛芬降解调节因子的深入研究奠定基础。【方法】以构建好的3G7Tn5突变体菌株为基础,借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶,将转座子Tn5从菌株3G7中电击转化至4F6,消除pKD46质粒,敲除4F6菌株中的C23O基因,测定出发菌株3G7、4F6及Tn5插入突变体菌株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5间位苯环的裂解活性。【结果】42℃条件下消除了Tn5插入突变体受体菌4F6中的pKD46质粒,构建了4F6-G9和4F6-H5突变体。Tn5转座子插入突变株3G7-G9、3G7-H5、4F6-G9和4F6-H5的间位苯环裂解活性无显著差异;菌株4F6的间位苯环裂解活性虽明显高于菌株3G7,但也仅有1个C23O基因,其活性差异可能与布洛芬降解调控因子有关。【结论】提供了一种简便有效定位并敲除C23O基因的方法。     

烟草青枯菌Tn5突变体库的构建及突变位点分析

为了从烟草青枯菌全基因组范围内发掘致病性相关基因,采用电转化法构建了一个EzTn5转座子介导的烟草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突变体库,该突变体库包含1.2万个突变子,经烟草上的致病性检测,共得到216个无致病力或弱致病力突变菌株。利用TAIL-PCR扩增获得其中15个无致病力烟草青枯菌的Tn5侧翼序列,并对其插入位点进行了分析,结果表明,15个突变菌株的插入位点分别位于核苷酸水解酶、糖基转移酶、转座酶和合成酶等具有不同功能的基因上,这些基因受到干扰或破坏后,可能会抑制致病相关物质的表达或分泌,或者诱导烟草对病原菌产生抗性,从而表现出无致病力特征。     

解淀粉芽孢杆菌Bs-18生防功能相关基因的初步鉴定

本研究利用平板筛选法,从转座子TnYLB-1转化的解淀粉芽孢杆菌Bs-18的突变体文库中筛选到生防作用发生明显变化的3株突变株。以这3株突变株为材料,通过反向PCR技术对突变体中转座子插入位点的侧翼序列进行BLAST比对分析,发现它们与野生芽孢杆菌的芽孢形成、细胞分离、细胞的一系列代谢活动等有关。     

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

成团泛菌对玉米自交系PS056致病性基因yhfK的克隆

 【目的】通过克隆和鉴定成团泛菌(Pantoea agglomerans)的致病相关基因,阐明该种土壤习居细菌在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的原因。【方法】利用转座子Tn5的随机插入突变特点,构建致病性菌株P. agglomerans XJ1突变体库;经对Tn5插入位点的侧翼扩增,确认突变体PA121的致病力相关基因;通过基因互补试验,证明yhfK与致病力的关系。【结果】通过对突变菌株的接种筛选,获得11个致病力丧失的突变体。Southern杂交和PCR扩增结果表明,Tn5在突变体PA121中为单拷贝插入,插入位点为细菌编码内膜蛋白的yhfK(Tn5 插入在yhfK的1 082 bp处)。将yhfK克隆到质粒pBBR1MCS上,并导入突变体PA121中进行互补,生物测定结果显示转化子完全恢复了正常的细菌生理功能,并能够在玉米自交系PS056上恢复致病力。RT-PCR试验证明,yhfK调控hrpA的转录。【结论】 成团泛菌XJ1中yhfK是调控其对植物致病性的基因之一,具有在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的功能。     

Tn5转座诱变选育冠菌素耐高温生产菌株及其发酵条件研究

利用双亲接合的方法将含有Tn5转座子的质粒pRL1063a导入丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syingae pv. glycinea）PG4180中,在含有卡那霉素和链霉素的MG平板上筛选抗性接合子。通过诱变,从874个突变株中筛选得到2株高温下产生冠菌素的突变株MFB132和MFB141。进而对菌株MFB141的发酵条件进行了优化,其最佳发酵条件为：2%葡萄糖为碳源,0.1%氯化铵为氮源,培养基初始pH为6.8,装液量为50 mL / 500mL,接种量为2%,发酵温度由原来的18℃上升到28℃,而发酵时间由原来的168 h缩短到108 h。在最优化条件下,出发菌株28℃下冠菌素产量仅为1.8 mg/L,而突变株MFB141在28℃下的产量达到37.66 mg/L,大约是出发菌株的21倍。     

水稻基腐细菌Tn5插入突变体库的构建及其致病相关突变体的筛选

采用转座子Tn5插入突变技术,共获得5 261个接合子。通过马铃薯软腐快速筛选和PCR检测验证,获得267个使马铃薯软腐能力丧失或下降的Tn5插入突变体,并测定其在水稻上的致病力和烟草上的过敏性坏死反应(HR)。结果表明:在267个突变体菌株中,对水稻无致病力的有71个,其中在烟草上无HR反应的有59个,产生HR反应的有12个;对水稻致病力下降的有68个,其余突变体菌株对水稻致病力与野生菌株差异不明显。另外,267个突变体菌株中有146个无HR反应,其中有90个对水稻无致病力或者致病力下降。致病力的分析结果表明,获得的突变体是由Tn5插入Dickeya zeae染色体上不同的致病相关基因位点导致的。     

瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础.     

水稻黄单胞杆菌水稻变种rpfA基因与毒性相关

水稻黄单胞杆菌水稻变种产生两种顺乌头酸酶（XooAcanA和XooAcanB)。编码其中的XooAcanA的rpfA基因已被克隆在重组质粒pGXN3000中。本研究通过转座子诱变pGXN3000及标记置换方法，构建了rpfA突变体T3A01。虽然T3A01丧失了合成顺乌头酸酶XooAcanA的能力，但仍然能够合成顺顺乌头酸酶XooAcanB，植株实验结果表明，该突变体的生长速率与野生型相似。但是引起的症状与野生型相比明显减弱，说明水稻黄单胞杆菌水稻变种的rpfA基因与毒性相关。     

应用转座子Tn5对生防菌P-936进行遗传改良的研究

以广谱性拮抗细菌荧光假单胞菌P-936为受体菌,大肠杆菌Escherichia coli S17-1 SM10/pSUP2021::Tn5为供体菌,通过结合转移技术,将转座子Tn5从供体菌中引入到受体菌P-936的基因组DNA中,共获得3011个Tn5插入突变体。在离体测定中,有4个突变体对稻瘟病菌的拮抗作用明显增强,有1个突变体完全丧失了拮抗作用;2个突变体对番茄青枯病菌的拮抗作用明显增强。通过盆栽和田间小区试验,突变体T-1207在连续3次防治后,对稻瘟病的防治效果达到61.97%,而野生菌株P-936的防治效果为51.55%,表现了一定的增效作用。