转基因棉花研究进展

江苏省农业科学院转基因棉花研究是在国家“863”计划的资助下进行的,有关项目组长期承担了“八五”、“九五”和“十五”国家“863”计划“抗虫棉的研制”等课题,以棉花转基因技术为突破口,与上下游相关单位密切配合,在转基因棉花的研究上取得了以下重要进展。1 花粉管通道法转基因技术 利用该技术突破了棉花遗传转化的技术“瓶颈”,将BT基因、CPTI基因、几丁质酶基因、葡聚糖氧化酶基因、葡萄糖氧化酶基     

棉花花粉管通道法转基因的分子细胞学机理研究

利用花粉管通道法转基因,由于具备不受基因型限制、操作简单、易于育种工作者掌握等显著特点,自我国科学家周光宇先生提出后,引起科学工作者的关注.目前,多数利用花粉管通道法获得转化后代的研究报告,提供了分子生物学证据.中国棉花抗虫转基因工程实践为花粉管通道法作了有力的实践证明.然而,国内外有些学者提出了种种看法,或者试图否认该方法的科学性(Potrykus,1990;Moore等,1997),或者对这一方法持观望态度.     

花粉管通道法转基因棉花后代特性的研究

研究发现转基因的受体材料、果台、外源基因、导入时间等条件的不同,直接影响到转基因后代成功与否。同时,利用花粉管通道法获得的棉花转基因后代,其中仅有少部分符合孟德尔遗传分离定律,多数后代的遗传分离比例变化较大,存在着遗传分离多样性,种植到T3-T4时,有外源DNA丢失现象,呈现出外源DNA遗传不稳定性。根据几年的实验研究,阐述了该方法在棉花转基因后代中出现的异常现象和问题。     

花粉管通道法转基因棉花后代筛选鉴定

通过对棕色棉BC05叶片进行Kan浓度梯度涂抹实验,确定了Kan涂抹筛选的最佳浓度为3.0 g/L,最佳观察时间为涂抹第5天。对Kan抗性植株进行PCR鉴定表明,Kan涂抹筛选可基本准确的鉴别出转基因材料与非转基因材料,但目标基因是否成功整合还必须进行PCR鉴定,田间卡那霉素筛选结合PCR分子鉴定是转基因棉花后代大规模群体筛选的有效方法。     

大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的获得

以大麦黄矮病毒GPV株系的RNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,扩增出1134bp的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到pUC19的SmaI位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒pUC19D。以KpnI和XbaI从pUC19D上切下此基因并插入质粒pEmu-mcs-N得到植物表达载体pPPI8。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴127、陕160和晋麦47,通过卡那霉素抗性筛选、PCR和PCR-Southern检测,3个品种均获得了转基因小麦植株。     

转植酸酶基因(phyA)玉米的PCR检测

采用CTAB法和SDS法对通过花粉管通道法导入植酸酶基因(phyA)的玉米植株,进行基因组提取并做了对比,认为SDS法效果更好,进而进行了PCR检测,并对PCR反应体系及反应条件进行优化,得出最适反应条件为57℃、模板含量1μL,检测得到了转基因阳性植株,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。     

新疆陆地棉抗病转基因棉花的初步筛选

通过花粉管通道法将天麻抗真菌蛋白基因导入新疆陆地棉3个品种(系),经过标记基因阳性试验和病圃生物学检测,得到初步的筛选结果.     

新疆抗棉铃虫、蚜虫转基因棉花的初步筛选

通过花粉管通道法将抗棉铃虫、蚜虫的外源基因导入新疆 7个棉花品种 (系 ) ,经过卡那霉素阳性反应试验和棉铃虫幼虫饲喂的生物学检测 ,得到初步的筛选结果     

花粉管通道法在植物转基因中的研究与应用

花粉管通道法是植物遗传转化的方法之一,它具有易于操作,适用范围广,育种时间短,有利于单子叶植物转化等特点。文章综述了该方法在水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、烟草以及番茄等重要农作物中的应用情况和研究进展。     

PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究

[目的]构建玉米通用表达载体,以期为利用转基因手段提高玉米对非生物胁迫的耐受性奠定基础。[方法]通过对现有的pGreen0229植物表达载体进行改造,构建含有CaMv35S启动子驱动的抗草胺膦筛选基因bar、可用于连接目的基因的玉米表达载体PGM-35Sbar,并通过花粉管通道法转化吉444玉米自交系。[结果]PGM-35Sbar玉米通用载体构建成功,转化玉米植株后,得到抗性植株14棵,经PCR检测其中有12棵为阳性植株。[结论]该研究为快速构建含有特定目的基因的玉米表达载体奠定了基础。     

花粉管通道法转基因抗虫棉外源基因的整合方式

对花粉管通道法培育的转Bt基因抗虫棉GK19、GK22、1016、1018、1022、1025、GK5、GKsu12和SGK1进行Southern杂交分析。结果表明,目的基因能够完整整合到基因组里,HindⅢ酶切位点有可能发生甲基化或丢失。除1018以外的上述8个抗虫棉的分析结果还表明,载体骨架没有整合到棉花基因组中。     

花粉管介导的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白转基因棉花的筛选

利用新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因进行遗传转化是培育新疆棉花抗寒品种的新途径. 研究采用RT-PCR结合RACE技术从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microdera puntip ennis dzungarica)中克隆获得抗冻蛋白(Antifreeze protein)基因Mp AFP149.将MpAFP149克隆至 pBI121上,获得重组质粒后采用电转化法将重组质粒转入农杆菌EHA105内,PCR筛选鉴定重组子,并测序确定抗冻蛋白植物表达载体构建正确.将pBI121-MpAFP通过田间的花粉管导入技术转化棉花,收取转化的棉花种子,经检测证明在转化10 000朵花中,卡那霉素抗性筛选出 13株,PCR检测有2株阳性植株.实验结果为进一步开展抗冻蛋白基因转化棉花的研究奠定了基础.     

hrpZ_(Psg12)基因植物表达载体的构建及花粉管通道法转化玉米的初步研究

利用hrpZPsg12转化玉米,以期得到对玉米病害具有广谱抗性的新种质材料,为抗病育种提供新的种质资源。以植物表达载体pCAMBIA3301为基础载体,采用PCR法从克隆载体pGM-hrpZPsg12克隆来自丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)的hrp ZPsg12基因,两端分别引入XhoⅠ酶切位点,构建了1个具有卡那霉素和除草剂草丁膦抗性标记的植物表达载体pCAMBIA3301-hrpZPsg12,并通过热激法转入到大肠杆菌DH5α中。采用花粉管通道法将构建好的植物表达载体的重组质粒导入玉米优良自交系"综31"中。结果表明:对得到的575株转化植株经PCR检测有45株呈阳性,阳性转化率为7.83%。     

昆虫抗冻蛋白基因Mpafp149对棉花内生菌的转化及转化菌回接棉花的耐寒性初探

【目的】将转化了小胸鳖甲抗冻蛋白基因的棉花内生菌回接棉花,检测转化菌在棉花的定殖及棉花的耐寒性,探索利用内生菌携带外源抗冻基因快速有效提高棉花耐寒性的方法。【方法】利用穿梭载体PBE2构建抗冻蛋白-绿色荧光蛋白转基因质粒;将重组质粒电转至内生菌,然后将转化菌回接棉花进行荧光检测;低温-1℃处理棉花后测定叶片电导率。【结果】重组质粒pBE2-Mpafp149-gfp转化内生菌M17可显著提高其抗冻性。转化的内生菌回接棉花后,在-1℃处理14 h的叶片相对电导率显著低于对照棉花,表明抗冻蛋白对棉花有一定的抗冻保护作用。荧光检测结果表明绿色荧光蛋白在转化菌回接组和对照组无明显差异。【结论】通过回接转化了外源抗冻基因的内生菌能够使棉花快速获得一定的耐寒性。植物组织自发荧光现象使通过绿色荧光蛋白检测转化菌回接情况的效果不明显。     

Bt杀虫蛋白基因导入新疆棉花获得抗虫转基因植株

通过花粉管通道法将人工全序合成的Ｂｔ杀虫蛋白基因导入新陆早４号和Ｃ６５２４两品种中,收获注射地Ｂｔ杀虫蛋白基因的棉花种子２万余粒。经棉铃局喂的抗虫性生物检测,得到高抗虫的１８株新陆早４号转化苗和３６株Ｃ６５２４转化苗;以Ｂｔ基因的一对引物进行ＰＣＲ分析,５４株抗棉铃虫的转化棉花苗均扩增出部分Ｂｔ杀虫蛋白基因的目标带。未转化的对照棉花苗则无此条带,证实Ｂｔ杀虫蛋白基因已整合到转化抗虫棉株的染色体上,     

Trxf1基因表达载体的构建及在加工番茄中的遗传转化

Trxf1是硫氧还蛋白家族中的一员,是组成硫氧还蛋白系统的重要组成部分,在植物的氧化逆境中发挥作用。为进一步研究该基因功能,通过RT-PCR方法从加工番茄叶片中克隆Trxf1基因的编码区,成功构建植物表达载体pBI121-Trxf1,采用农杆菌介导法转化番茄,经PCR、RT-PCR分析表明,植物表达载体已成功整合到番茄基因组中。实时荧光定量PCR研究表明,加工番茄Trxf1基因在其根、茎、叶、花等器官中均有表达,且在叶片中表达量最高。     

水蛭素基因植物表达载体的构建

在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下,根椐植物基因密码子选择偏向,对水蛭素基因序列进行了改造．在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、poly(A)尾、XbaⅠ和SacⅠ双酶切位点．将所合成序列与双元载体pBI121重组,构建成pBI121-hir植物高效表达载体．经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定,该载体构建成功．     

棉花深棕色纤维基因Lc1的遗传定位

 【目的】研究棉花棕色纤维的遗传规律,寻找并定位与棕色纤维基因连锁的分子标记,为进一步在棉花基因组学水平上定位、克隆棕色纤维基因和棕色棉纤维品质改良奠定基础。【方法】基于陆地棉显性多基因标记系T586（具有深棕色纤维基因Lc1）与海岛棉新海16配制的海岛棉×陆地棉杂交F2群体,结合色彩色差仪对棕色纤维色泽的分类进行分析,并充分利用棉花基因组分子标记遗传连锁图谱信息、多态性分子标记筛选和图位克隆的方法,定位与棕色棉纤维基因Lc1连锁的分子标记。【结果】根据T586与新海16杂交后代F2群体（443个有效纤维单株）深棕色纤维、棕色（中间色）和洁白色纤维的分离比例,将Lc1定位于棉花基因组A亚组第7染色体微卫星标记NAU4030和CGR5119之间约8 cM的遗传距离内,其中,Lc1与标记CGR5119的遗传距离约为2.8 cM,与NAU4030之间的遗传交换距离约为5.1 cM,构建了Lc1位点的遗传连锁图谱。【结论】棉花深棕色纤维性状由单基因控制并呈现半显性遗传方式,Lc1位点附近的分子标记信息可在棕色棉分子标记辅助育种中得以利用。     

转Bt基因棉对多异瓢虫生长发育及中肠组织变化研究

[目的]研究转Bt基因棉花对多异瓢虫生长发育及中肠组织的变化.[方法]用取食转Bt-Cry 1Ab/Ac基因棉棉蚜喂饲多异瓢虫,初步研究了取食转Bt-CryAb/Ac基因棉棉蚜对多异瓢虫的影响.利用透射电镜观察取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉和取食对照花粉的多异瓢虫中肠组织的变化.用ELISA检测方法在取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉的多异瓢虫体Bt毒蛋白进行了检测.[结果]多异瓢虫Hippodamia variegata取食棉蚜后各个虫态均无显著差异;利用透射电镜观察取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉和取食对照花粉的多异瓢虫中肠组织,发现其微绒毛、线粒体、内质网均无显著变化;用ELISA检测方法在取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因花粉的多异瓢虫体内没有检测到Bt毒蛋白.[结论]取食转Bt-Cry1Ab/Ac基因棉棉蚜和花粉对多异瓢虫生长发育没有明显影响.