FTN_0109蛋白对土拉弗朗西斯菌致病力的影响

土拉弗朗西斯菌是一种重要的人畜共患性病原菌,目前对该菌的毒力因子及分子致病机制尚不完全清楚。本研究旨在分析未知功能蛋白FTN_0109在土拉弗朗西斯菌中的分布,探讨其对细菌致病力的影响。通过生物信息学软件预测FTN_0109的生物学功能,并利用超速离心法检测其亚细胞定位;利用同源重组技术构建FTN_0109基因缺失株及其反式回补株,分析其对三种来源小鼠巨噬细胞的入侵和细胞内增殖能力,并检测其对BALB/c小鼠的致病力和在其体内的繁殖动态。结果显示,FTN_0109蛋白被预测为一种脂蛋白,主要分布于土拉弗朗西斯菌的内膜;与野毒株相比,FTN_0109缺失株在小鼠巨噬细胞中不能增殖,对BALB/c小鼠的LD_(50)提高10~4以上,在感染小鼠肝和脾中的载量呈不断下降趋势且均显著低于野毒株(P0.05)。结果提示,FTN_0109是一种内膜脂蛋白,它的缺失可严重降低土拉弗朗西斯菌在小鼠巨噬细胞和体内的生存能力,降低其对小鼠的致病力。     

布鲁氏菌VirB8变异株的构建及其感染力和毒力的测定

作者拟对缺失致病力因子--四型分泌系统中的VirB8基因后布鲁氏菌感染力和毒力的变化进行测定与分析.首先,构建了布鲁氏菌VirB8基因缺失株(△B8B.suis),用缺失株感染巨噬细胞和BALB/c小鼠,再用B.suis强毒攻击BALB/c小鼠并检测脾脏含菌数,观察其在动物体内定居能力、毒力及抗感染保护力.鉴定△B8B.suis为VirB8基因完全缺失株,△B8B.suis感染巨噬细胞6、24和48 h,其CFU分别为49、165和355;△B8B.suis感染BALB/C小鼠的每克脾含菌数为3.6×107(1×108CFU腹腔接种)和5×106(1×109CFU蹊部接种);BALB/c小鼠攻毒试验显示△B8B.suis免疫组每克脾平均含菌数为7.61×102,非免疫对照组为2.98×105.结果表明布鲁氏菌缺失VirB8基囚后,其毒力较亲本株弱,但能在小鼠脾脏定居,为弱毒株;△B8B.suis呈现出作为疫苗的生物学特性,但毒株能否作为疫苗株使用,还需进一步验证.     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析

为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果显示经PCR扩增及序列分析表明获得基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对巨噬细胞的侵袭能力显著下降(p<0.01);其溶血活性比野生株降低2个滴度;并且该缺失株对BALB/c小鼠的LD50为4.253×108 cfu,高于野生株3个数量级;免疫保护试验显示,经缺失株免疫的小鼠对野生株攻毒有75%的免疫保护率。本研究构建了基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对小鼠具有较好的免疫保护效果,以上研究为减毒李斯特菌疫苗载体的研发奠定重要基础。     

伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株（PRV-Ea）为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。     

鼠伤寒沙门菌CVCC541 rhs基因内部元件缺失株的构建及其功能

利用Red同源重组系统构建5株rhs内部元件缺失株以及回补株,并通过HeLa细胞黏附和侵袭试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬后存活试验、小鼠致病力试验鉴定rhs内部元件缺失后对菌株黏附能力、侵袭能力和小鼠致病力的影响。旨在通过敲除鼠伤寒沙门菌CVCC541的2个rhs基因的内部元件rhs-1N、rhs-1core、rhs-1C、rhs-2core和rhs-2C构建相应缺失株及回补株,研究其对该菌侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明,鼠伤寒沙门菌rhs基因内部元件的缺失均增强了其黏附侵袭和抗吞噬能力,但极显著降低了该菌的致病力。回补株对生长速率没有影响,其黏附侵袭能力与亲本株相比没有显著差异,抗吞噬能力与亲本株相比均有显著差异,对小鼠致病力与亲本株相比显著降低。     

金黄色葡萄球菌ClfA基因缺失株的生物学特性

采用检测金黄色葡萄球菌Clf A缺失株在固、液体培养基中生长规律发现Clf A缺失株的生长繁殖力弱于强毒株;药敏试验结果表明Clf A缺失株和强毒株在对苯唑西林和新霉素的敏感性上有变化,缺失株对苯唑西林和新霉素更为敏感;通过小鼠腹腔、后腿注射细菌,观察小鼠生理状态变化,表明后腿注射缺失株的小鼠行走正常,触摸有肿胀结块,剖后肌肉有出血点,注射强毒株的小鼠有拖地行走现象,肌肉细胞发生溶解消失,注射Clf A缺失株对小鼠毒力弱于强毒株;建立细菌感染乳腺模型并制作组织切片观察组织病变,结果显示乳腺注射Clf A缺失株的母鼠乳腺有化脓灶,有的中性粒细胞坏死崩解,注射野毒株的小鼠乳腺与周围组织发生粘连,乳腺间质增宽,血管扩张充血,部分乳腺泡发生了溶解脱落;抗体水平检测中,Clf A缺失株攻毒后血清中IgG含量低于强毒株和对照组。结果表明,Clf A基因在细菌生长和致病中起了重要作用,金黄色葡萄球菌Clf A基因缺失株在生长繁殖力和致病力上比强毒株446株明显减弱。     

流感病毒PR8F的拯救及其对BALB/c小鼠的致病力

为了研究H1N1流感病毒对BALB/c小鼠的致病相关分子机制、传播机制以及开发新型疫苗,将本实验室保存的A/PR/8/34株的8个质粒参照Paulina构建的流感病毒8质粒突变系统做定点突变,利用反向遗传操作技术,成功拯救出H1N1流感病毒突变株PR8F。将PR8F株以106 TCID50/100μL的剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠临床表现及体质量变化。解剖攻毒后不同时间小鼠并观察体内主要脏器的病理特征,提取各脏器RNA,通过实时荧光定量PCR方法,检测PR8F株在小鼠体内不同脏器中的病毒残留量和在BALB/c小鼠肺脏中的扩增效率。结果表明,H1N1流感病毒突变株PR8F感染小鼠4~7d后全部致死;PR8F株在小鼠体内各脏器中的病毒残留量有很大差异,肺脏中最多,且病毒在肺脏内呈指数形式扩增。本试验建立了H1N1流感病毒PR8F株对BALB/c小鼠的感染模型,为H1N1流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定基础。     

蜥蜴利什曼原虫在小鼠体内的分布及增殖研究

通过腹腔途径用体内含有荧光蛋白的蜥蜴利什曼原虫感染BALB/c小鼠,感染后采其脏器做冰冻切片,荧光染料染色后用荧光显微镜观察,并经PCR鉴定,结果显示蜥蜴利什曼原虫感染小鼠后,主要分布于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏。另外,成功建立了利什曼原虫荧光定量PCR检测方法,并采用该方法检测感染蜥蜴利什曼原虫后BALB/c小鼠体内利什曼原虫的增殖情况,结果显示,感染13 d内,BALB/c小鼠体内蜥蜴利什曼原虫呈波浪状增殖。这一结果为研究蜥蜴利什曼原虫感染人和动物的致病机理和免疫方法及疫苗研制等方面提供了基础理论依据。     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位sefA和sefD基因缺失株的致病性研究

为研究SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌中的致病作用,本实验将SEF14菌毛亚单位编码基因缺失的肠炎沙门氏菌突变株50336△sefA和50336△sefD分别接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,比较它们与其亲本菌株50336的致病性差异。结果显示,亲本菌株50336以及突变株50336△sefA、50336△sefD对小鼠的半数致死量分别为19.95 cfu、7.94 cfu和7.94 cfu,表明两个突变株对小鼠的致病性显著增强;而且对雏鸡的致病性结果也显示,突变株50336△sefA致病力较强,其感染雏鸡组死亡率为15%,而亲本菌株组死亡率为8.6%;另外50336△sefA和50336△sefD感染组7日龄时平均增重分别为15.38 g和18.39 g,亲本菌株组为19.06 g,对照组为26.43 g。研究结果表明SEF14菌毛亚单位基因缺失对肠炎沙门氏菌的致病性具有增强作用。     

牛种布鲁氏菌ClpS基因突变株的构建及其对毒力的影响

试验旨在探究ClpS基因在布鲁氏菌中的作用,分析比较ClpS基因突变对布鲁氏菌毒力的影响。利用同源重组技术,构建布鲁氏菌ClpS基因突变株,通过检测细菌生长曲线、细菌LPS合成能力及其在巨噬细胞内的存活能力和小鼠模型中的毒力,比较亲本株2308和突变株ΔClpS两者之间的差异。结果显示,在相同的培养条件下,亲本株2308和突变株ΔClpS的细菌浓度无明显差异,且两者提取的LPS银染结果基本一致,表明ClpS基因突变不影响布鲁氏菌生长速度,不影响细菌LPS合成;在细胞感染模型中,突变株ΔClpS在感染后72 h的胞内存活能力极显著低于亲本株2308（P<0.01）;小鼠感染试验显示,在感染后1周,亲本株2308感染组和突变株ΔClpS感染组小鼠脾脏重量及细菌含量无显著差异,但在感染后4周,突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏细菌含量为10^3.93 CFU/g脾脏,显著低于亲本株2308（10^6.68 CFU/g脾脏,P<0.01）,且突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏肿胀程度极显著低于亲本株2308（P<0.01）。综上所述,布鲁氏菌ClpS基因突变不影响细菌生长速度及细菌LPS合成能力,但ClpS基因突变可降低布鲁氏菌在小鼠脾脏内的定殖能力。     

Construction of Brucella ClpS Gene Mutant Strain and Its Effect on Virulence

The present study aimed to determine the role of ClpS gene,and to analyse the impact of ClpS mutation on the virulence of Brucella.A ClpS gene mutant strain,named ΔClpS was constructed by homologous recombination technology.The bacterial growth kinetics,the LPS synthesis ability and the survival ability of bacterial within macrophages as well as the virulence in mouse model were measured.In addition,the difference between parent strain 2308 and the mutant strain ΔClpS were compared.The results showed that under the same culture conditions,no difference in bacterial concentration was observed between 2308 and ΔClpS strains.The silver staining examination showed that the expression level of LPS extracted from two strains were similar,indicating ClpS gene mutation did not alter the growth rate and LPS synthesis ability of Brucella. In the cell infection assay,the survival ability of ΔClpS strain in cells was extremely significantly lower than that of 2308 strain at 72 h after infection (P<0.01).The results of mouse infection experiment showed that in the first week after infection,no significant difference in spleen weight and bacterial concentration between 2308 and ΔClpS strains infected mice was observed.However,at 4 weeks after infection,the bacterial concentration in spleen of ΔClpS infected mice was 10^3.93 CFU/g spleen,which was significantly lower than that of 2308 strain (10^6.68 CFU/g spleen,P<0.01).The spleen weight of ΔClpS infected mice was also remarkably lower than that of 2308 strain (P<0.01).In summary,the results suggested that the ClpS gene of Brucella did not play a role in Brucella growth rate and ability of LPS synthesis,whereas ClpS gene mutation decreased the ability of Brucella colonization in mouse spleen.     

国内部分省市肉兔及蜱虫携带土拉杆菌的流行病学调查

本调查旨在探明土拉杆菌在国内部分省份的流行情况。利用本实验室建立的土拉杆菌通用及亚种PCR检测研究方法，对国内肉兔饲养密度比较大的省份和牛羊存栏的部分省市开展了肉兔和蜱虫中土拉杆菌的检测，并对阳性样本进行了土拉杆菌亚种的鉴定和基因测序验证。研究结果表明，肉兔肝脏组织和牛羊携带蜱虫中土拉杆菌DNA检测阳性，其中218份肉兔样本中12份阳性（阳性率5.5%），490份蜱虫样本中15份阳性（阳性率3.1%）；从地区分布来看，山东、河南、四川肉兔病料检测阳性，云南、山东蜱虫阳性率高；PCR检测显示其亚种为F.h，为土拉杆菌毒力较强的亚种。本次调查显示土拉杆菌在肉兔、蜱虫中存在，山东、云南地区存在土拉杆菌病公共卫生安全风险，应引起有关科研院校、医疗单位和政府部门的高度重视。     

Epidemiological Investigation of Francisella tularensis Transmitted by Rabbits and Ticks in Some Provinces of China

The aim of this investigation was to find out the prevalence of Francesella tularensis in some provinces of China. Using the general and subspecies PCR detection method for Francesella tularensis established in our laboratory, PCR detection of Francesella tularensis in rabbits and ticks was carried out in provinces with high-density rabbits feeding and some provinces and cities with sheep and cattle stock. The results showed that DNA detection of Francesella tularensis from rabbit tissues and ticks carried by cattle and sheep was positive. 12 out of 218 rabbit samples were positive (5.5% positive rate), and 15 tick samples were positive (3.1%) of 490 tick samples. In terms of geographical distribution, most of the positive rabbit samples were from Shandong, Henan and Sichuan province, however, ticks collected from Yunnan and Shandong province showed a higher positive rate. PCR detection showed that Francesella tularensis subspecies in this investigation was F.h, which was a subspecies with strong toxicity. This investigation revealed that Francesella tularensis presented in rabbits and ticks, public health and safety risks of Francesella tularensis existed in Shandong and Yunnan province, which should be paid more attention by the relevant scientific research institutions, medical institutions and government departments.     

牛坏死杆菌的43 ku外膜蛋白在其黏附细胞中的作用初步分析

旨在明确牛坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)的43 ku外膜蛋白(43K OMP)在其黏附细胞中的作用，本研究将重组43K OMP蛋白和天然43K OMP蛋白与鼠乳腺上皮细胞共孵育，通过免疫荧光方法观察牛坏死杆菌43K OMP对鼠乳腺上皮细胞的黏附作用；同时利用天然蛋白竞争试验和抗体抑制试验明确43K OMP是否介导牛坏死杆菌与细胞的黏附，进一步利用牛坏死杆菌43K OMP基因缺失菌，评价43K OMP基因缺失对牛坏死杆菌黏附力的影响，阐明43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中的作用。免疫荧光试验结果显示：天然43K OMP和重组43K OMP均能黏附于鼠乳腺上皮细胞表面，天然43K OMP与鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞预孵育后，牛坏死杆菌黏附数量明显下降(P＜0.05)；牛坏死杆菌与43K OMP多抗或单抗预孵育后，黏附于鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞的牛坏死杆菌数量显著降低(P＜0.05)；与牛坏死杆菌A25菌株相比，基因缺失菌A25Δ43K OMP黏附宿主细胞能力极显著下降(P＜0.01)，黏附率分别降低了94.4%和90.4%。因此，43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中发挥关键性作用，深入研究其黏附机理将为揭示牛坏死杆菌致病机制提供理论基础。     

Inactivation of the sodA gene of Streptococcus suis type 2 encoding superoxide dismutase leads to reduced virulence to mice

Superoxide dismutase (SOD) is a virulence factor of certain pathogenic bacteria by diminishing the effect of oxidative burst of phagocytic cells. Earlier reports indicated the presence of manganese-cofactored SOD in Streptococcus suis type 2 (SS2). However, the biological role of SOD and its coding sequence in SS2 has not yet been characterized. The SSU1356-ORF of a clinical SS2 strain ZJ081101 encodes a protein of 201 amino acids with 81-88% identity to SodA of other Streptococcus spp. A sod deletion mutant (Δsod) from the clinical strain was constructed. SOD activity was absent in the cell extract from the Δsod mutant, but present in that from the wild-type or the sod-complemented (CΔsod) strain. The Δsod mutant was more susceptible to oxidative stresses induced by hydrogen peroxide or paraquat. Survival of the sod deletion mutant in RAW264.7 macrophages was only half of that of the wild-type strain. Deletion of sod significantly attenuated virulence of SS2 to mice. Effects of such genetic deletion were complementable using the strain CΔsod. The co-inoculation experiment in mice revealed that the Δsod mutant was far more easily cleared from the body than the wild-type strain as shown by about 3-log reduction of its infection potential in blood and tissues. In summary, we reveal an important role of SOD in pathogenesis of S. suis type 2, most probably by scavenging reactive oxygen species from macrophages.     

单增李斯特菌双元调控系统hssS/hssR缺失株的构建及其生物学特性

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌,可抵抗外界多种不利因素的影响,如酸、碱、渗透压和氧化应激.双元调控系统(two-component system,TCS)是细菌适应环境的重要调控系统,为了探明双元调控系统HssS/HssR对单增李斯特菌抗应激能力及毒力...     

副猪嗜血杆菌小鼠毒力和仔猪毒力的相关性分析

旨在对我国最为流行的血清4、5、12和13型副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis， HPS）（共36株）进行BALB/c小鼠和仔猪毒力试验的比较研究。小鼠毒力试验结果表明，4种血清型菌株的LD₅₀分别介于9.80×10⁷~4.60×10⁹、2.10×10⁸~8.85×10⁹、4.81×10⁷~7.01×10⁹和1.75×10⁸~8.45×10⁸ CFU；整体毒力表现强弱依次是13、4、12、5型，但仅在5型与13型菌株之间毒力具有显著差异（P<0.05）。仔猪毒力试验结果表明，同一血清型中不同菌株的毒力具有明显差异，均存在强毒和弱毒菌株；整体毒力表现强弱依次是5、13、4、12型；但5型与4型（P=0.039）和12型（P=0.033）之间具有显著差异（P<0.05），与13型差异不显著（P=0.241）。综合对比分析HPS的小鼠和仔猪毒力试验结果，可以得出3个结论：1）4种国内流行性血清型菌株的整体毒力由强到弱依次是5、13、4和12型；2）但同一血清型中均存在强毒和弱毒菌株，HPS的血清型与其毒力之间不具有相关性；3） HPS虽能致死BALB/c小鼠，但其毒力结果与仔猪毒力试验结果并不一致，表明其作为替代模型具有一定的缺陷。