猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立

本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒(CSFV)E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43～77.65μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R~2值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

为了建立起双抗体夹心ELISA定量测核衣壳蛋白(caspid protein,Cap)抗原方法,采用氯化铯密度梯度超速离心方法制备猪圆环病毒2型Cap蛋白标准品,制备出针对PCV2-Cap单克隆抗体及PCV2-Cap多克隆抗体,筛选最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度,绘制标准曲线,验证方法,并应用该方法对不同转移载体构建的PCV2-Cap蛋白随时间变化的表达量进行测定。结果显示:最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度均为1∶10 000,标准曲线的范围是15.6~250 ng/m L,线性相关系数≥0.99,准确性为(103.46±12.50)%,特异性良好;检测不同转移载体构建的Cap表达量随时间的变化,发现Cap含量接种后24 h开始表达,72 h达到高峰,呈S形曲线增长模式。结果表明:已建立的双抗体夹心ELISA定量测Cap抗原方法灵敏度、精密性和准确性均符合研究要求。     

检测非洲猪瘟病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立

利用非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体,1株作为捕获抗体,另1株用辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为检测抗体,采用方阵法对ELISA反应条件进行优化,建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果显示,该方法中捕获抗体包被质量浓度为1.25 mg/L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1∶4 000。通过试验确定该方法的临界值为0.299,当样品D₄₅₀值≥0.3,且P/N大于2时,判定为阳性。该双单抗夹心ELISA方法可特异性检测ASFV抗原,其他抗原检测结果均为阴性,特异性强;重复性好,批内和批间变异系数(CV)均小于8%。应用本研究建立的方法与荧光PCR方法同时对225份临床样品进行检测,总符合率为96.89%。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于ASFV抗原的大量样品检测,为ASF防控提供了技术支持。     

细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种早期诊断动物细粒棘球蚴病的方法,诱导表达含PET-EgAgB8/2载体的原核表达菌,以表达纯化蛋白为抗原,制备单克隆抗体,并以制备的抗体建立检测细粒棘球蚴病夹心ELISA方法。结果显示,原核表达菌在37℃诱导培养,菌体上清中大量表达,经验证为目的蛋白,用纯化蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选得到9株具有良好特异性、稳定分泌单克隆抗体的细胞株,经两两配对,选择75C86/15作为包被抗体,27E57/32为酶标二抗,当包被抗体浓度为1.42μg/mL, 4℃包被过夜、用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭、抗原作1∶100稀释、酶标二抗1∶1 000稀释、反应底物作用15 min时效果最佳,检测方法的特异性为98.8%,敏感性为95.3%。成功制备细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单克隆抗体并建立了ELISA检测方法。     

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白阻断ELISA检测方法的建立

为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。     

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体检测试剂盒(ELISA)的研制

为建立检测严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)血清总抗体的双抗原夹心ELISA方法并进行初步试用.通过原核表达得到SFTSV-NP重组蛋白,以该蛋白作为ELISA的包被和酶标记抗原,确定抗原的最佳包被浓度和血清稀释度,优化各项试验条件,在此基础上研制试剂盒,并对试剂盒的重复性、特异性等方面进行研究.结果发现抗原最适包被浓度为4.0μg/ml,血清的最佳稀释浓度为1:40,重复性试验表明批内和批间的变异性都低于10﹪.该试剂盒敏感性高、特异性强、重复性良好,可应用于SFTSV的研究和临床检测.     

基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原ELISA方法的建立及应用

应用制备的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CC13B毒株E2蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV)抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵试验确定的捕获BVDV抗原的单克隆抗体最佳抗体包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释浓度为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准为待检样品D₄₉₀值≥0.156 7时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果显示,建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的单抗捕获BVDV抗原的夹心ELISA方法,调查了山东、河南和吉林3省部分地区牛群BVDV感染情况,发现上述地区牛群的BVDV感染率低至6%。本研究结果为BVDV感染的诊断、检疫、净化及防制提供了有效的技术手段及流行病学理论依据。     

猪附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立和应用

为建立猪附红细胞体双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗猪附红细胞体单克隆抗体为捕获抗体,兔抗猪附红细胞体多克隆抗体为检测抗体,优化工作条件,建立猪附红细胞体DAS-ELISA检测方法.结果显示:该方法的最佳工作条件为:捕获抗体包被浓度为5.42 g/mL,检测抗体浓度为6.84 g/mL,酶标...     

猪瘟病毒Erns和E2蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究将CSFV Erns和E2基因的主要抗原区进行克隆,构建pET32a-Erns和pET32aEK-E2重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化,以纯化的rErns、rE2重组蛋白为包被抗原,经条件优化,分别建立CSFV rErns和rE2抗体间接ELISA检测方法.SDS-PAGE结果显示,...     

猪瘟抗体间接ELISA检测方法的建立和优化

采用真核系统表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被物,通过对各个反应条件的摸索和优化,建立了检测猪瘟病毒抗体的猪瘟抗体间接ELISA检测方法。研究结果表明,E2蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳包被条件为4℃16h;待检血清的最佳稀释倍数为100倍;特异性检测试验证明,该方法与猪常见病原的阳性血清没有交叉反应。通过对大量猪瘟抗体阴、阳性血清的检测,最终确定了本检测方法的判定标准。     

Establishment and Preliminary Application of Indirect ELISA Based on Recombinant NS4 Protein for Detection of Bluetongue Virus Antibodies

This study was conducted to establish an indirect ELISA method for the detection serological antibody of bluetongue virus (BTV). The purified BTV recombinant NS4 protein obtained from the prokaryotic express system was used as the coated antigen, and then an indirect ELISA antibody detection method of BTV was developed by optimizing the reaction conditions. SDS-PAGE results showed that the recombinant NS4 protein with a size of about 52 kDa was obtained, which mainly existed in the supernatant. Western blot results showed that the purified recombinant NS4 protein had good antigenicity. The ELISA reaction conditions were optimized by the square matrix test. The optimal coating amount of recombinant NS4 protein antigen was determined to be 3.0 μg per well, and the optimal dilution ratio of serum to be tested was 1:200, and the optimal dilution concentration of HRP-labeled rabbit anti-cow IgG secondary antibody was 1:4 000, and the critical values were 0.29 and 0.35, respectively. The detection sensitivity of the BTV antibody was up to 1:1 600. The intra-assay repeatability and the inter-assay repeatability coefficient of variation were less than 10%. The positive coincidence ratio and negative coincidence ratio were 98% and 100% respectively. The indirect ELISA method established in this study laid a foundation for clinical serum antibody detection and serum epidemiological investigation of BTV.     

基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立蓝舌病病毒（BTV）血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0 μg·孔^-1;血清最佳稀释倍数为1：200,酶标二抗最佳工作浓度为1：4 000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1：1 600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

建立牛结核病的γ-干扰素(BovIFN-γ)免疫学检测方法。本研究利用rBovIFN-γ抗原免疫Balb/c小鼠,经5次免疫后,通过淋巴细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备抗BovIFN-γ的单克隆抗体,在McAb及多克隆抗体的基础上建立双抗体夹心ELISA,并进一步优化ELISA反应条件。结果表明,获得一株能稳定分泌抗BovIFN-γ McAb的杂交瘤细胞株A12E9,分泌单克隆抗体腹水效价为1∶107,属于IgG1亚类,具有良好的特异性;所建立的双抗体夹心ELISA方法,BovIFN-γ最低检测限为40 ng/mL,与其他蛋白不发生交叉反应,表现出良好的特异性。该方法为建立牛结核病的γ-干扰素诊断方法奠定了基础。     

猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价

以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。     

Establishment and Application of an Indirect ELISA with Recombinant N Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

To establish a sensitive,specific and efficient method of antibody detection for porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV),PRRSV N protein was expressed through prokaryotic expression system and purified by affinity chromatography to act as a coating antigen.Then an indirect ELISA detection method for serum PRRSV antibody was finally set up after the optimization of reaction conditions.Besides,the research also involved cross reaction,repeated experiments,and comparison with other ELISA kits.It was determined that the optimum concentration of coating antigen was 2 μg/mL and that the dilution ratio for serum was 1:100,with 30 min of incubation and 10 min of chromogenic reaction.With this method,positive serum samples of five common swine pathogens,including classical swine fever virus（CSFV),porcine circovirus（PCV）and porcine pseudorabies virus（PRV）and so on,were tested,and the results were negative.Both intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 10%,and the comparison with commercial ELISA kits indicated that its accuracy was 94.7%.So this indirect ELISA,which had been established in this research,could provide a rapid diagnosis for swine infected by wild PRRSV and applied in epidemiological investigation,as a convenient and efficient serological antibody detection method.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30 min,显色时间为10 min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。     

猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立

为了建立一种快速定量检测猪伪狂犬病病毒（PRV）gB蛋白抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法,以大肠杆菌表达并纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的抗gB蛋白单克隆抗体作为酶标抗体,以国家参考品稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测,成功建立的PRV-gB-CLEIA在45 min内即可完成检测,可检测到最大稀释倍数为1：2 048稀释的国家参考品;与猪瘟等其他5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应;批内变异系数为1.13%~9.47%,批间变异系数为2.43%~14.07%,重复性和稳定性较好。通过对采集的180份临床血清检测结果进行比较,该方法与中和试验阳性符合率为94.00%,阴性符合率为96.92%,总符合率为96.11%,明显优于商品化ELISA试剂盒。本研究建立的PRV-gB-CLEIA检测方法可以用于PRV gB抗体的快速定量检测。