GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞自噬与凋亡的影响

【目的】细胞自噬和凋亡存在着相互制约,p38MAPK信号通路作为细胞凋亡的主要调控通路之一,也对细胞自噬存在促进和抑制的双重作用。已有研究表明,促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)对细胞自噬与凋亡均有影响,但作用机制尚不明确。故探究GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞(pGCs)自噬与凋亡的影响及其机理,为解决母猪的产子率以及同期发情等问题提供参考。【方法】从猪卵巢中提取卵巢颗粒细胞,进行体外培养。1、探究GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间:按孵育GnIH时间梯度(0min、10 min、30 min、60 min、90 min)分组,用Western blot检测猪卵巢颗粒细胞p38与p-p38的蛋白表达量变化;2、验证GnIH对p38MAPK信号通路的影响:按(空白对照、GnIH、p38激活剂(U-46619)、U-46619+GnIH)分组,用Western blot检测p38与p-p38的蛋白表达量变化;3、探究不同浓度GnIH对自噬和凋亡的影响:按(空白对照、10-6 mol·L-1 GnIH、10-8 mol·L-1 GnIH、10-10 mol·L-1 GnIH、10-12 mol·L-1 GnIH)分组,用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化;4、验证不同浓度GnIH通过p38信号通路对自噬和凋亡的影响:将细胞分成6组(空白对照、U-46619、U-46619+10-6 mol·L-1 GnIH、U-46619+10-8 mol·L-1 GnIH、U-46619+10-10 mol·L-1 GnIH、U-46619+10-12 mol·L-1 GnIH),用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化。【结果】1. GnIH孵育10 min后,显著降低p38与p-p38的蛋白表达量(P0.05),提示,GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间为10 min;2. U-46619显著促进pGCs的p38磷酸化水平(P0.05),GnIH显著抑制pGCs的p38磷酸化水平(P0.05),提示,U-46619使p38MAPK信号通路活化,GnIH对p38MAPK信号通路的活化有抑制作用;3.当GnIH的浓度为10-6 mol·L-1时,pGCs的自噬和凋亡水平显著升高(P0.05),随着GnIH浓度的降低,pGCs的自噬水平逐渐升高(P0.05),pGCs的凋亡水平逐渐降低(P0.05),提示,高浓度GnIH可以促进自噬和凋亡,随着GnIH浓度的降低,自噬水平逐渐升高,而凋亡水平逐渐下降;4.加入U-46619后,GnIH使pGCs的自噬显著上调(P0.05),并且使pGCs的凋亡显著下调(P0.05),提示,不同浓度GnIH通过p38MAPK信号通路影响pGCs的自噬和凋亡。【结论】GnIH可能通过抑制p38MAPK信号通路的活化,上调pGCs的自噬,减少pGCs的凋亡。     

硒对S. aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

【目的】硒（Se）能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以10 ⁶细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8 μmol·L ^-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+S. aureus）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组（bMECs+2 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）、Mid组（bMECs+4 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）和Hig组（bMECs+8 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）,每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。 【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.01）。S. aureus感染0.5 h后,Nod2蛋白水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加2 μmol·L ^-1 的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒可显著抑制Nod2的表达（P<0.05）; S . aureus感染0.5 h后,RIP2蛋白水平显著升高（P<0.05）,而在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）; S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里分别添加4 μmol·L ^-1 和8 μmol·L ^-1 硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.05）。 【结论】硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻S. aureus诱导的bMECs炎症反应。     

大豆异黄酮对早期断奶仔猪生长性能、抗氧化功能及肠粘膜形态结构的影响

【目的】 研究饲粮中添加大豆异黄酮对早期断奶仔猪生长性能和抗氧化作用及免疫功能的影响。【方法】 选用160只5.5 kg 21日龄断奶的（杜×长×大）三元杂交仔猪,根据体重和性别随机分成5组,每组4个重复（公母各4只）。各处理组饲粮大豆异黄酮添加水平分别为0（空白对照组）、10、20、40、80 mg·kg^-1。试猪饲养至7、42d时每个重复分别选取平均体重的试猪屠宰并取样测定。【结果】 断奶后8—42 d和整个试验期阶段,大豆异黄酮40 mg·kg^-1组平均日采食量显著高于空白对照组、10 mg·kg^-1大豆异黄酮组和20 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后8—42 d时,大豆异黄酮20 mg·kg^-1组料重比显著低于空白对照组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后7d,肝脏中丙二醛（MDA）含量随大豆异黄酮添加水平提高有降低的趋势,其中添加大豆异黄酮40和80 mg·kg^-1 组试验猪肝脏中的MDA含量显著低于空白对照组和10 mg·kg^-1 大豆异黄酮组。添加大豆异黄酮20 mg·kg^-1 组仔猪血清超氧化物歧化酶（SOD）活性显著高于空白对照组、40 mg·kg^-1 大豆异黄酮组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。添加大豆异黄酮10 mg·kg^-1 组肝脏组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著高于对照组和80 mg·kg^-1 大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后8—42 d时,20 mg·kg^-1大豆异黄酮组试验猪料重比显著低于空白对照组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶42d时,添加大豆异黄酮40 mg·kg^-1 组血清SOD活性显著高于空白对照组、10 mg·kg^-1 大豆异黄酮组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。大豆异黄酮20 mg·kg^-1组肝脏的GSH-Px活性显著高于空白对照组和80 mg·kg^-1 大豆异黄酮组（P<0.05）。断奶后42d,大豆异黄酮40和80 mg·kg^-1组的空肠SOD活性显著高于对照组（P<0.05）;添加大豆异黄酮40 mg·kg^-1组空肠的GSH-Px活性显著高于对照组和10 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）;饲粮大豆异黄酮对空肠的金属硫蛋白（MT）含量有显著影响作用,其中大豆异黄酮10 mg·kg^-1组空肠的MT含量显著高于空白对照组（P<0.05）。断奶后7、42d对照组仔猪十二指肠绒毛成舌状排列,绒毛顶端凹陷且脱落严重,各处理组与对照组相比,十二指肠绒毛损伤程度降低,其中40 mg·kg^-1组仔猪十二指肠绒毛最完整,成柱状排列。添加大豆异黄酮对断奶仔猪42d的血液中CD4⁺的水平有显著影响作用,对淋巴细胞转化率、CD8⁺、CD4⁺/ CD8⁺无显著影响（P>0.05）,其中大豆异黄酮10和20 mg·kg^-1组血液中CD4⁺水平显著低于空白对照组和80 mg·kg^-1大豆异黄酮组（P<0.05）。【结论】 饲粮中添加大豆异黄酮能够提高断奶仔猪的生长性能,增强机体的抗应激能力,对肠绒毛有一定的保护作用,早期断奶仔猪大豆异黄酮适宜添加量为40mg·kg^-1。     

miR-31-5p对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明：在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid）预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA, CDK1, CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）和促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组（P<0.01）;双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高（P<0.01）,结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性（P<0.01）;同时,qPCR及Western Blot表明：过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达（P<0.01）。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力（P<0.01）,通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组（P<0.01）,促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后, G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组（56.81%,P<0.01）,减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,降低了促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】 miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。     

姜黄素通过Nrf2信号通路对H2O2诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的缓解

【目的】验证姜黄素是否能够通过转录因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）信号通路减轻H₂O₂诱导的奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激,为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的氧化损伤提供理论依据。【方法】培养奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,用500 μmol·L^-1H₂O₂处理MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L^-1）处理3 h;MAC-T细胞转染Nrf2 siRNA 48 h后,用500 μmol·L ^-1 H₂O₂处理奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L^-1）处理3 h。采用实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和试剂盒等方法,检测Nrf2的蛋白表达量及下游靶基因NAD（P）H醌氧化还原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1）和血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）的mRNA及蛋白表达量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等氧化应激相关指标的活性及含量。【结果】（1）H₂O₂处理组MAC-T细胞中MDA含量显著高于对照组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著低于对照组（P<0.01）。15 μmol·L^-1姜黄素+H₂O₂共同处理组和30 μmol·L^-1姜黄素+H₂O₂共同处理组MAC-T细胞中MDA的含量显著低于H₂O₂处理组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著高于H₂O₂处理组（P<0.05,P<0.01）。（2）H₂O₂处理组总Nrf2蛋白水平显著低于对照组（P<0.01）,H₂O₂处理组Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著低于对照组（P<0.01）。姜黄素处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）,姜黄素处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于对照组（P<0.01）。姜黄素+H₂O₂处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于H₂O₂处理组（P<0.01）,姜黄素+H₂O₂处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于H₂O₂处理组（P<0.01）。（3）si-Nrf2组与对照组相比,Nrf2的mRNA表达水平显著降低（P<0.01）。si-Control+H₂O₂+姜黄素组与si-Control+H₂O₂组相比,MDA的含量显著降低（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著升高（P<0.01）。si-Nrf2+H₂O₂+姜黄素处理组与si-Control+H₂O₂+姜黄素组相比,MDA的含量显著升高（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.01）。【结论】姜黄素可以通过增加Nrf2的表达,诱导下游抗氧化分子的转录从而缓解H₂O₂诱导奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激。本研究为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤提供理论依据。     

对母猪生殖调控的研究

【目的】研究促性腺激素抑制激素（GnIH）mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH（10^-6、10^-8、10^-10 和 10^-12 mol·L^-1）对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素（雌二醇,孕酮）的合成、细胞增殖相关蛋白（cyclin B1,PCNA）表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10^-6和10^-10 mol·L^-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌（P＜0.01）, 但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达（P＜0.01）。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。     

虾青素对牛子宫内膜细胞炎症损伤的保护作用

【目的】利用虾青素较强的抗氧化特性,通过探讨黏膜屏障重塑对脂多糖（LPS）诱导的牛子宫内膜细胞炎症的影响,为牛子宫内膜细胞炎的预防和治疗提供理论基础。【方法】培养液中添加1 μg·mL ^-1 LPS,培养子宫内膜细胞6 h,检测培养液中炎症因子TNF-α和IL-6含量,建立细胞的体外炎症模型。在此基础上去掉培养液,重新加入含1×10 ^-6 mol·L ^-1 虾青素的新鲜培养液,继续培养细胞24 h。对照组为不添加LPS或AST,LPS组为仅添加LPS,AST组为添加LPS和AST。采用ELISA法检测培养液中TNF-α和IL-6炎症因子分泌量以及细胞SOD和CAT酶活性,利用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平,利用免疫荧光染色检测细胞紧密连接蛋白Claudin、CDH1、TJP1的分布情况,利用荧光定量RT-PCR法和Western Blot法分别检测Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平。【结果】利用1 μg·mL ^-1 LPS培养子宫内膜细胞6 h,检测发现培养液中炎症因子IL-6和TNF-α分泌水平显著高于对照组（P小于0.05）,说明LPS诱导子宫内膜细胞产生炎症反应。与对照组相比,细胞内ROS水平显著增加（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著降低（P小于0.05）,说明LPS诱导的子宫内膜细胞炎症造成了氧化损伤。加入1×10 ^-6 mol·L ^-1 虾青素培养细胞24 h后,发现培养液中IL-6和TNF-α因子的分泌水平显著低于LPS组（P小于0.05）,同时ROS阳性细胞比率显著下降（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著升高（P小于0.05）。LPS组与对照组相比,细胞膜处Claudin、CDH1、TJP1蛋白的荧光信号减弱,这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著降低（P小于0.05）。加入1×10 ^-6 mol·L ^-1虾青素培养24 h后,与LPS组相比,在细胞边缘和细胞核内可以检测到荧光信号很强的Claudin、CDH1、TJP1蛋白,而且这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著升高（P小于0.05）。【结论】虾青素通过降低子宫内膜细胞因炎症反应产生的氧化损伤,减轻炎症导致的子宫内膜细胞紧密连接结构损伤,对子宫内膜的物理免疫屏障起保护作用,为牛子宫内膜炎的预防和治疗提供理论借鉴意义。     

酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌的致死效应

【目的】研究酸性电解水（AEW）能否有效控制肉源性荧光假单胞菌,探究处理后菌体变化,为新型杀菌剂的开发提供思路。【方法】使用不同有效氯浓度酸性电解水（20、40和60 mg?L ^-1）将肉源性荧光假单胞菌分别处理5、10、15、20、25和30 min后,通过平板计数检测酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌的致死效果;收集未处理及20、40和60 mg?L ^-1酸性电解水各处理5 min后菌液,利用扫描电子显微镜观测酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌细胞形态的影响;利用多种荧光探针检测酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌细胞膜完整性、胞内pH、胞内ATP浓度、膜电位的影响;提取胞外聚合物（EPS）探究酸性电解水与EPS的相互作用。 【结果】20、40和60 mg?L ^-1的酸性电解水均可在5 min内杀死10 ⁷CFU/mL肉源性荧光假单胞菌,酸性电解水浓度大于40 mg·L ^-1时对肉源性荧光假单胞菌的杀菌效果没有显著影响（P>0.05）,10 min处理后均已无活菌检出。扫描电子显微镜结果表明3种浓度酸性电解水的处理均可使肉源性荧光假单胞菌菌体干瘪皱缩,失去原本饱满的细胞形态,60 mg·L ^-1电解水处理下破损程度最大。酸性电解水可显著降低肉源性荧光假单胞菌的膜完整性、胞内pH、膜电位、胞内ATP浓度和EPS含量（P<0.05）。20、40和60 mg·L ^-1酸性电解水处理后菌体膜完整性分别降低到2.26%、1.87%和1.20%,膜电位分别消散40%、50%和50%,胞内pH由7.50分别降低到6.53、5.90和5.83,3种浓度处理后胞内ATP浓度已降至最低。杀菌效果显著依赖于酸性电解水浓度的升高,当处理浓度高于40 mg?L ^-1时,胞内pH、膜电位和胞内ATP浓度的降低无显著差异。酸性电解水处理下EPS中蛋白、总糖含量显著降低,松散胞外聚合物 （L-EPS）中蛋白和总糖分别降低71.08%和62.23%,而紧密胞外聚合物（B-EPS）中蛋白和总糖分别降低99.32%和40.62%。当EPS反向添加到酸性电解水中时则可显著降低酸性电解水氧化还原电位（ORP）（P<0.05）,但对有效氯浓度（ACC）和pH没有显著影响（P>0.05）。 【结论】酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌具有良好的杀菌效果,可破坏肉源性荧光假单胞菌细胞膜,同时EPS对酸性电解水杀菌效果具有一定的阻碍作用。     

肉用绵羊生长期甲烷排放特点与预测模型的建立

【目的】通过探索生长期肉用绵羊的甲烷（CH₄）排放规律,旨在建立相关的CH₄预测模型。【方法】采用单因素试验设计,以饲粮NFC/NDF（非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维）为0.78自由采食组的平均日增重作为饲粮NFC/NDF为1.03组和2.17组的限饲标准,在此基础下测定肉用绵羊的生长性能、营养物质消化率和甲烷产量,并分析肉用绵羊不同体重阶段的甲烷产量与饲粮干物质基础下的营养物质含量、营养物质摄入量、可消化营养物质摄入量及营养物质消化率间的回归关系。【结果】预测肉用绵羊生长早期（25—35 kg）CH₄产量的最佳一元和多元回归模型分别为：CH₄（L·d ^-1）= -26.58×NFC/NDF + 92.7（R ² = 0.772,P <0.001）;CH₄ (L·d ^-1)=2.71×NDFD-2.45×DMD-0.97 CPD+124.46（R ²=0.846,P=0.001）。预测肉用绵羊生长后期（48-55 kg）CH₄产量的最佳一元和多元回归模型分别为：CH₄ (L/d)=-57.00×GE (MJ·kg ^-1)+1076.0（R ²=0.581,P=0.002）;CH₄/BW ^0.75(L/kg ^0.75)=-0.013×NDF intake (g/d)-0.13×CP intake (g/d)+0.02×DM intake (g/d)+0.84（R ²=0.652,P=0.019）。而肉用绵羊生长期整体CH₄产量的最佳一元和多元预测模型分别为：CH₄(L/d)=-26.94×NFC/NDF+90.71（R ²=0.655,P <0.001）;CH₄/BW ^0.75(L/kg ^0.75)=0.005×Digestible NDF intake (g·d ^-1)+0.011×Digestible DM intake (g·d ^-1) - 0.097×Digestible CP intake (g·d ^-1)-4.78 （R ²=0.722,P <0.001）。 【结论】建立了肉用绵羊独立生长阶段（25—35 kg、48—55 kg）和整体生长阶段（25—55 kg）的CH₄预测模型。研究表明,处于不同体重阶段的肉用绵羊的最佳甲烷预测因子不尽相同,且甲烷产量受饲粮NFC/NDF影响较大。这可为今后评估我国饲养模式下的甲烷产量提供理论依据,也可为肉用绵羊饲粮的合理配制提供技术参考。     

根际盐分差异性分布对高粱幼苗生长发育的影响

【目的】盐碱地盐分含量在土壤表层的分布通常是不均匀的,研究不均匀盐胁迫条件下高粱幼苗生长发育和生理生化指标的变化,可为盐碱地高粱栽培和盐碱地高效开发利用提供理论依据。【方法】 利用分根法将高粱根系均匀分成2部分,并分别置于不同浓度（mmol·L ^-1）NaCl中,设置对照为无盐胁迫（记作0/0,下同）、不均匀盐处理（0/200、50/150）和均匀盐处理（100/100）,在人工气候室培养14 d后取样,测量生物量、叶面积、SPAD值、根系形态、渗透调节物质、抗氧化酶活性和光合参数等性状,研究分根盐胁迫条件下高粱生长发育的变化规律。 【结果】 不均匀盐胁迫和均匀盐胁迫均严重影响了高粱幼苗的生长发育,显著降低了高粱幼苗鲜重、干重和叶面积,对叶片的光合能力、抗氧化酶活性和渗透调节物质均有一定程度的影响。然而,不均匀盐处理50/150和0/200的单株干重比均匀盐处理提高了21.19%和62.71%,单株鲜重提高了35.39%和86.44%,叶面积提高了13.22%和88.66%;50/150处理低盐一侧根系鲜重和干重分别是高盐一侧的1.90倍和2.10倍,0/200处理无盐一侧根系鲜重和干重分别是盐胁迫一侧的3.02倍和3.75倍。同样,不均匀盐处理对局部根系形态影响显著,低盐或无盐一侧根系生长明显增加,50/150和0/200处理低盐一侧的根系长度、根系体积、根尖数和分支数显著高于高盐或有盐胁迫一侧根系,进而不均匀盐胁迫条件下整个根系的根系长度、根系体积、根尖数和分支数都高于均匀盐胁迫处理,其中0/200处理的各项指标与均匀盐处理差异均达到显著性水平（P<0.05）。叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性在不均匀盐胁迫条件下显著升高（P<0.05）;不均匀盐处理的叶片渗透调节性物质脯氨酸（PRO）和可溶性糖（SS）含量显著高于均匀盐处理,丙二醛（MDA）含量显著下降（P<0.05）。不均匀盐处理条件下植株光合能力相对于均匀盐处理也得到显著改善,主要体现在显著升高的光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）;相较于均匀盐处理,在不均匀盐处理条件下50/150、0/200的荧光参数实际光化学效率（ΦPSⅡ）、最大光化学效率（Fv/Fm）和电子传递效率（ETR）分别提高了5.64%和19.00%、9.25%和18.89%、1.93%和6.89%,其中0/200处理的ΦPSⅡ和Fv/Fm与100/100处理的差异达到显著性水平（P<0.05）。【结论】 不均匀盐处理和均匀盐处理对高粱幼苗生长均产生抑制,但在不均匀盐胁迫条件下,由于低盐或无盐一侧根系补偿性增长,整个根系形态得到改善,叶片抗氧化酶活性、渗透调节能力和光合能力均有一定程度提高,因而缓解盐胁迫对高粱幼苗的危害。     

黄花蒿醇提物对奶牛乳腺细胞中共轭亚油酸 合成相关酶基因表达的作用

目的 通过奶牛乳腺上皮细胞体外培养试验,研究黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中与共轭亚油酸（CLA）合成相关酶的基因SCD表达的影响,探讨其对乳脂肪合成相关酶ACACA和FASN基因以及与脂肪转运相关酶LPL基因表达的影响,旨在从乳腺层次探明黄花蒿乙醇提取物对乳中CLA合成的部分作用机制。方法 将采自于健康泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织用保温盒带回实验室,在无菌条件选取腺泡较多的深层组织,采用胶原酶消化法获得乳腺上皮细胞,放于37℃,CO₂浓度为5%的培养箱中进行原代培养。试验所用的细胞是经过复苏的第二代细胞,待细胞复苏后,以3×10 ⁴个/mL的密度接种细胞到24孔板中,分别置于37 ℃的5% CO₂培养箱中培养,采用台盼蓝计数法每天进行一次计数,设3个重复,连续7 d,未计数组每2天换液一次,绘制细胞生长曲线。另外,待细胞生长至对数增殖期,更换新鲜培养液,随机分为4组,即培养液中黄花蒿提取物的浓度为0、3.0、6.0、12.0 mg·L ^-1 ,提取物作用时间均为48 h,检测不同浓度黄花蒿提取物对与脂肪酸合成相关酶SCD、ACC、FAS、LPL 基因表达量的影响。每个处理3个重复。结果 使用倒置显微镜观察,乳腺上皮细胞形态呈铺路石样;在3×10 ⁴个/mL的接种密度下,细胞生长曲线呈S型,在1—2d乳腺上皮细胞为潜伏期,3—6d为指数增长期,之后进入平台期,符合一般细胞生长曲线规律,说明培养的乳腺上皮细胞具有正常的增殖能力,可以用于后续的研究;与对照组相比,添加黄花蒿乙醇提取物有增加SCD酶基因表达量的趋势,其中3mg·L ^-1组显著增加了SCD酶的基因表达量(P<0.05),而6 mg·L ^-1组和12mg·L ^-1组虽然增加了SCD酶的基因表达量,但与对照组相比差异不显著(P>0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有增加乳腺上皮细胞中ACACA基因表达量的趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05),且随着添加剂量的增加,有下降趋势;添加黄花蒿乙醇提取物可以增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量,呈剂量依赖型增加,且12mg·L ^-1组可以显著增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量(P<0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有降低乳腺上皮细胞中LPL基因表达量的趋势,呈剂量依赖型降低,且6 mg·L ^-1组和12mg·L ^-1组显著降低了乳腺上皮细胞中LPL基因表达量(P<0.05)。结论 黄花蒿乙醇提取物可以增加奶牛乳腺上皮细胞中SCD、ACACA和FASN酶基因的表达,有利于调控CLA和乳脂肪的生成。     

伏马毒素B1对猪体外成熟卵母细胞凋亡与自噬的影响

[目的]探究伏马毒素B,(fumonisin B1,FB1)对猪卵母细胞体外成熟的影响及其潜在的作用机制,为临床有效防治FB1所致的生殖毒性损伤提供理论参考.[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度FB1(0、10、...     

赤红壤蔗区11年连续增量施磷下磷素演变及其 对甘蔗产量与磷流失的影响

【目的】 系统分析连续11年增量施磷下赤红壤蔗地土壤全磷、Olsen-P以及地表径流磷流失量的变化特征和土壤磷素变化与磷盈亏、蔗茎产量的响应关系,为土壤磷素科学管理提供参考。【方法】 依托长期肥力及地表径流定位监测试验（2008年—）,选取不施肥（CK）、推荐施肥（OPT）和增量施磷（OPT+P）3个处理,测定土壤全磷、Olsen-P含量及地表径流磷流失量,分析土壤磷素变化与磷累积盈亏量的关系,采用Mitscherlich模型拟合蔗茎产量对Olsen-P的响应曲线,计算土壤Olsen-P农学阈值,并推算施肥处理土壤Olsen-P含量从第11年降至环境阈值所需的时间。【结果】 CK处理逐年降低土壤全磷含量,年降速率为0.0251 g·kg ^-1·a ^-1。施肥土壤全磷和Olsen-P含量随种植年限波动增加,土壤全磷和Olsen-P增速率OPT+P处理高于OPT处理。不施肥土壤表观磷盈亏10.2 kg·hm ^-2·a ^-1,施肥处理土壤表观磷盈余41.3—69.2 kg·hm ^-2·a ^-1,占施磷量的31.9%—35.6%,以OPT+P处理显著高于OPT处理67.5%。施肥下赤红壤蔗区土壤全磷和Olsen-P变化量均与土壤累积磷盈亏量呈显著正相关关系（P＜0.01）,土壤每累积盈余100 kg P·hm ^-2,OPT处理和OPT+P处理土壤全磷上升0.06 g·kg ^-1和0.09 g·kg ^-1,Olsen-P 含量上升11.0 mg·kg ^-1和9.1 mg·kg ^-1。土壤每累积亏缺100 kg P·hm ^-2,CK处理土壤全磷下降0.32 g·kg ^-1。Mitscherlich模型较好地拟合蔗茎产量与赤红壤Olsen-P含量的响应关系（P＜0.01）。其计算出的土壤Olsen-P 农学阈值为12.1 mg·kg ^-1。施肥显著提高地表径流磷流失量,且OPT+P处理也显著高于OPT处理。地表径流磷流失量与土壤Olsen-P含量显著正相关。基于土壤磷素变化与累积磷盈亏的关系推算得出第11年OPT和OPT+P处理Olsen-P水平降至环境阈值的时间分别需要12年和16年。 【结论】 在南方赤红壤区,施肥尤其增量施磷在提高土壤磷素累积的同时增加了地表径流磷流失风险。在本试验磷的基础养分条件下,按OPT处理施磷,并从甘蔗种植的第2—3年实行隔年施磷可维持土壤磷素处于农学阈值与环境阈值之间。     

施氮与刈割留茬高度对草场生产力及植物群落组成的影响

【目的】 改善打草场土壤养分,提高草地生产力及维持草地可持续利用。【方法】 2016—2018年在呼伦贝尔草地农业生态系统实验站打草场设置5个施氮水平（0、10、20、30、40 g·m^-2·a^-1）与2个刈割留茬高度（4、8 cm）,裂区试验设计,分别于每年6月中旬和8月中旬进行试验处理,研究其对草地植物群落及功能群的物种丰富度、地上生物量、主要物种组成的重要值、优势种功能性状及土壤理化性质的影响过程。【结果】 施氮与刈割留茬高度对群落及功能群的物种丰富度无显著影响（P<0.05）。施氮显著增加禾草功能群及群落的地上生物量（P<0.05）,分别提高了72.7%—126.3%、61.6%—96.1%,但施氮量在10—40 g·m^-2·a^-1的各处理间差异不显著（P<0.05）,低刈割留茬高度使禾草的地上生物量显著降低了18.3%（P<0.05）。施氮显著增加羊草（Leymus chinensis）的重要值,降低无芒雀麦（Bromus inermis）的重要值（P<0.05）。施氮时低刈割留茬高度显著降低羊草的重要值,增加无芒雀麦的重要值,不施氮时则相反。低留茬高度显著增加二裂委陵菜（Potentilla bifurca）和星毛委陵菜（Potentilla acaulis）的重要值,降低糙隐子草（Cleistogenes squarrosa）的重要值（P<0.05）。施氮显著增加无芒雀麦及羊草的株高、叶面积和地上部氮素含量（P<0.05）,但施氮量在20—40 g·m^-2·a^-1的各处理间差异不显著。土壤pH、土壤含水量随施氮量增加而显著降低,土壤NH₄⁺-N、NO₃^--N及总无机氮（ION）含量随施氮量增加而显著增加（P<0.05）。群落、禾草及杂类草的物种丰富度与土壤含水量显著正相关,群落及禾草的地上生物量与土壤含水量显著负相关（P<0.05）。【结论】 短期施氮与适宜的刈割留茬高度提高草地植物群落生产力及稳定群落的物种组成,施氮效应依赖于水分的有效性。呼伦贝尔草甸草原打草适宜刈割留茬高度为8 cm,适宜施氮量为10—20 g·m^-2·a^-1。