小鼠NIS蛋白的生物信息学特征及其在乳腺中的表达分析

为探究小鼠钠碘转运体(Na~+/I~- symporter,NIS)蛋白的结构、功能及其在乳腺组织的表达特征,本研究扩增小鼠乳腺NIS基因编码区,测序鉴定后采用结构预测软件对NIS蛋白进行生物信息学分析,同时采用Western blotting、免疫组织化学技术和半定量PCR技术对NIS基因在不同乳腺发育时期的转录和表达水平进行分析。结果显示,小鼠NIS基因编码区全长1 857 bp,与人NIS的同源性为80.40%,保守性较强。NIS蛋白含有618个氨基酸残基,分子质量约为65.7 ku,分子式为C_(2996)H_(4701)N_(749)O_(833)S_(32),理论等电点为7.44,半衰期为30 h,消光系数为102 510,不稳定系数为29.31,脂溶系数为105.91,富含疏水性氨基酸,为稳定的疏水蛋白。NIS蛋白二级结构含有α-螺旋(41.42%)、延伸链(18.28%)、β-转角(4.05%)和无规则卷曲(36.25%),三级结构与之相一致。Western blotting结果显示,4个时期均出现特异性杂交带,大小为65.7 ku,与预期结果相符。免疫组织化学结果表明,NIS蛋白在小鼠的青春期、妊娠期到泌乳期的乳腺组织中表达量逐渐增加,在泌乳期达到高峰,存在显著差异(P0.05),在退化期逐渐恢复到类似青春期状态;NIS基因mRNA的变化规律与蛋白表达一致。本研究结果为进一步探究NIS蛋白在乳腺发育和泌乳调控中的作用提供了参考依据。     

成年小鼠Myomaker基因克隆及组织表达分析

为研究Myomaker基因在成年小鼠骨骼肌中的表达情况，试验从随机抽取的3只健康成年小鼠骨骼肌中提取总RNA，通过PCR方法扩增Myomaker基因的编码区序列（CDS），并对其进行生物信息学分析。此外，利用免疫组织化学和Western blotting法分析Myomaker蛋白在小鼠骨骼肌组织中的定位与表达。结果显示，Myomaker基因CDS区全长666 bp，编码221个氨基酸，同源性比对结果显示，小鼠与斑马鱼、鸡、猫、牛、犬、人、鹦鹉、猪Myomaker基因CDS区同源性分别为71.7%、80.7%、83.7%、83.2%、84.1%、86.4%、80.6%和84.0%，氨基酸同源性分别为75.9%、79.3%、85.5%、85.5%、88.3%、86.9%、81.4%和93.2%。Myomaker基因编码蛋白分子式为C₁₁₅₄H₁₇₆₉N₂₇₅O₂₉₅S₁₈，分子质量为24 ku，等电点为9.14，不稳定性指数为39.22，平均疏水性为0.501。免疫组织化学和Western blotting分析表明，小鼠Myomaker蛋白在健康成年小鼠骨骼肌中存在表达，且表达于部分肌细胞膜上。本试验结果可为Myomaker基因的深入研究奠定基础。     

奶牛SP1基因结构及对乳脂合成功能的初步分析

旨在探讨中国荷斯坦奶牛的特异性蛋白1（specificity protein,SP1）基因结构特征及其对奶牛乳脂合成的影响。根据NCBI已经公布的奶牛SP1基因序列（NM_001078027.1）,利用生物信息学分析其序列保守性、理化性质、蛋白亲水性、蛋白质结构及互作蛋白;采用PCR技术扩增并克隆SP1基因CDS序列。然后,选取6头健康的中国荷斯坦奶牛,分别取泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织,运用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测SP1基因在不同时期奶牛乳腺组织中的表达情况。分离并纯化泌乳期奶牛乳腺上皮细胞,通过SP1过表达及干扰检测其对乳脂合成的影响,分别进行3次独立试验。结果显示,SP1基因序列在不同物种间高度保守,与山羊相似度最高（98.94%）。奶牛SP1基因CDS区序列长2 361 bp,编码786个氨基酸,蛋白分子质量为80 902.17 u,理论等电点为6.94。平均疏水指数为-0.438,为不稳定的亲水性蛋白。SP1序列包含3个锌指结构,SP1蛋白二级结构以无规则卷曲（52.29%）为主。STRING蛋白互作分析结果显示,SP1与转录因子AP-1（JUN）、雌激素受体α（ERα）、MYC原癌基因蛋白（MYC）、TATA盒结合蛋白（TBP）等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,SP1的mRNA和蛋白在泌乳期的表达量显著高于干奶期（P<0.01）。在奶牛乳腺上皮细胞中过表达SP1显著增加细胞甘油三酯的合成（P<0.01）,而干扰SP1的表达,甘油三酯合成显著降低（P<0.01）。以上结果提示,SP1正向调控乳脂合成,分析SP1基因结构和功能为深入研究SP1对泌乳奶牛乳脂合成调控机制提供理论依据。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式，进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程，本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化；在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸，采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响；采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路，使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示，在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期（P<0.05，P<0.01）；在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平（P<0.01）；亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路（P<0.05），而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达（P<0.05，P<0.01），进而极显著抑制β-Casein的合成（P<0.01）。以上研究结果表明，4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关，亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达，进而影响乳蛋白的合成。     

草原红牛肝配蛋白A5基因克隆及其在不同组织中的表达研究

研究旨在克隆中国草原红牛肝配蛋白A5（ephrin A5，EFNA5）基因，并对其进行生物信息学分析，检测EFNA5基因在中国草原红牛不同组织中表达的差异。以中国草原红牛为研究对象，根据GenBank公布的牛EFNA5基因序列（登录号：NM_001076432.1）设计引物，PCR扩增获得EFNA5基因的完整编码区（CDS）序列后进行测序验证，利用分析软件进行序列相似性比对并构建系统进化树；分析对应的氨基酸序列蛋白理化特性并预测蛋白亚细胞定位、蛋白亲/疏水性和磷酸化位点；预测蛋白二级结构并构建蛋白三级结构模型；以实时荧光定量PCR法检测EFNA5基因在中国草原红牛各组织中的相对表达量。结果显示：中国草原红牛EFNA5基因与普通牛和美洲野牛相似性最高，分别为100%和99.8%，与羊、人的相似性分别为95.6%、97.2%，与海豚、鸡、马、猕猴、小鼠和猪的相似性较低，分别为83.6%、85.8%、84.5%、84.9%、84.1%、82.8%；EFNA5基因CDS大小为687 bp，编码228个氨基酸，EFNA5基因编码蛋白的分子式为C₁₁₈₃H₁₇₉₁N₃₁₅O₃₃₉S₁₃，总原子数为3 641，分子质量为26.266 ku，理论等电点为5.97，不稳定系数为49.66，总平均亲水性为-0.313。磷酸化位点预测分析发现，EFNA5蛋白共有27个磷酸化位点；亚细胞定位结果表明，EFNA5蛋白主要位于细胞质（26.1%）、分泌系统囊泡（27.1%）、细胞核（13.0%）、线粒体（13.0%）、质膜（8.7%）、内质网（4.3%）、高尔基体（4.3%）、细胞骨架（4.3%）及液泡（4.3%）中；二级结构主要由α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲组成，分别占18.9%、30.2%、26.4%和24.5%，与三级结构预测结果相符；EFNA5基因在中国草原红牛不同组织的相对表达量差异较大，在肾脏和胃组织中表达量较高，在肺脏组织中表达量最少。本研究结果可为进一步筛选草原红牛肉质候选基因提供参考。     

成年小鼠Myomaker基因克隆及组织表达分析

为研究Myomaker基因在成年小鼠骨骼肌中的表达情况,试验从随机抽取的3只健康成年小鼠骨骼肌中提取总RNA,通过PCR方法扩增Myomaker基因的编码区序列(CDS),并对其进行生物信息学分析。此外,利用免疫组织化学和Western blotting法分析Myomaker蛋白在小鼠骨骼肌组织中的定位与表达。结果显示,Myomaker基因CDS区全长666bp,编码221个氨基酸,同源性比对结果显示,小鼠与斑马鱼、鸡、猫、牛、犬、人、鹦鹉、猪Myomaker基因CDS区同源性分别为71.7%、80.7%、83.7%、83.2%、84.1%、86.4%、80.6%和84.0%,氨基酸同源性分别为75.9%、79.3%、85.5%、85.5%、88.3%、86.9%、81.4%和93.2%。Myomaker基因编码蛋白分子式为C_(1154)H_(1769)N_(275)O_(295)S_(18),分子质量为24ku,等电点为9.14,不稳定性指数为39.22,平均疏水性为0.501。免疫组织化学和Western blotting分析表明,小鼠Myomaker蛋白在健康成年小鼠骨骼肌中存在表达,且表达于部分肌细胞膜上。本试验结果可为Myomaker基因的深入研究奠定基础。     

绵羊NYD-SP27基因的原核表达及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊NYD-SP27基因进行克隆和原核表达，并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中绵羊NYD-SP27基因序列（登录号：KX905090）设计1对特异性引物，通过PCR方法扩增目的基因片段，构建pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞，提质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达，对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定，并利用生物信息学方法对NYD-SP27基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示，试验成功扩增出大小为1 617 bp的NYD-SP27基因片段，并经NdeⅠ和Xho Ⅰ双酶切获得大小为5 400和1 617 bp的两条片段，表明成功构建了pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒，诱导表达重组蛋白大小约60 ku，主要以包涵体的形式存在。NYD-SP27蛋白分子式为C₂₇₉₈H₄₃₁₉N₇₃₇O₈₁₉S₁₉，原子总数为6 892，理论等电点（pI）为6.16，为酸性蛋白，不稳定系数为46.96，属于不稳定蛋白，总平均亲水性为-0.403。该蛋白无跨膜结构，无信号肽，含有45个潜在的磷酸化位点和24个抗原表位；NYD-SP27蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占26.21%、3.90%、18.03%和51.86%。本试验结果可为深入研究绵羊NYD-SP27蛋白的作用机理提供理论依据。     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型（BPIV3）的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板，利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶（HN）的基因片段，然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段（HNex基因），并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中，经双酶切连接至pET-30a（+）表达载体中，构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex，转化大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS感受态细胞，IPTG诱导后，用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原，制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示，本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明，53 ku处有特异条带出现，并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1：819 200。Western blotting结果表明，制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之，本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白，并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体，为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

为深入研究Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family，member A，Rhoa）和环氧合酶2（cyclooxygenase 2，Ptgs2）分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用，试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆，构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列（登录号：JN971019.1和NM_011198）设计引物，提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA，经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序，将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接，对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后，利用Lipofectamine^TM 2000转染293T细胞，经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况，并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示，试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒；实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达；Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带，而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示，Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高，在不同物种之间较为保守；Rhoa不具有信号肽，为不稳定蛋白，而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽，为稳定蛋白；Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点；二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体，均在转录水平上表达，并分析了其生物学功能，为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。     

中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体的构建

[目的] 对中华蜜蜂（Apis cerana cerana）中自噬相关蛋白Atg8家族成员γ-氨基丁酸相关受体蛋白（gamma-aminobutyric acid receptor type associated protein,GABARAP）基因进行克隆鉴定和生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行原核表达,以期为后续探究该基因的功能奠定基础。[方法] 根据GenBank中西方蜜蜂（Apis mellifera）GABARAP基因序列（登录号：XM_001120069.5）设计引物,采用巢式PCR对中华蜜蜂GABARAP基因进行扩增、克隆;运用生物信息学软件对其氨基酸序列相似性、二级结构、三级结构进行比对和预测分析;构建GABARAP基因原核表达载体,利用Western blotting对GABARAP蛋白进行鉴定后并用IPTG诱导纯化。[结果] 经巢式PCR扩增得到中华蜜蜂GABARAP基因序列;使用在线BLAST工具对氨基酸相似性进行分析显示,中华蜜蜂GABARAP与西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、东方熊蜂的氨基酸序列相似性为100%;氨基酸序列系统进化树显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂亲缘关系最近,与秀丽隐杆线虫亲缘关系最远。生物信息学分析结果显示,GABARAP基因编码区全长354 bp,编码117个氨基酸,蛋白分子质量为13.99 ku,理论等电点为9.48;GABARAP蛋白二级结构主要由3个α-螺旋、4个β-折叠和6个多肽结合位点构成,二、三级结构预测结果一致;SDS-PAGE分析结果显示,IPTG诱导的GABARAP蛋白分子质量为35 ku;Western blotting鉴定结果证明了His单克隆抗体可以特异性识别GABARAP蛋白。[结论] 本研究成功克隆了中华蜜蜂GABARAP基因,获得了GABARAP蛋白并进行了生物信息学分析,为进一步研究GABARAP基因及其蛋白在自噬发生中的作用提供了参考。     

山羊ACSS2基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对山羊乙酰辅酶A合成酶2（acetyl-CoA synthetase 2,ACSS2）基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量变化。以山羊乳腺组织RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并克隆山羊ACSS2基因完整CDS区序列,对测序结果进行生物信息学分析,并对ACSS2基因在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量进行分析。结果显示,山羊ACSS2基因CDS区序列长2 106 bp,编码701个氨基酸;山羊ACSS2基因与牛、马、人、犬、猪、小鼠和鸡的同源性分别为97.8%、92.0%、91.3%、91.3%、91.1%、88.1%和73.3%。蛋白理化性质分析结果表明,ACSS2蛋白分子质量为78.72 ku,理论等电点为6.03,属于酸性蛋白;跨膜结构和信号肽分析表明,ACSS2蛋白不含跨膜结构和信号肽;结构域分析表明,该蛋白含有1个乙酰辅酶A合成酶N端结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白主要分布在内质网（44.4%）、线粒体（33.3%）、细胞质（11.1%）和细胞核（11.1%）中。蛋白质结构预测发现ACSS2蛋白含有α-螺旋（29.10%）、延伸链（21.54%）、β-转角（9.84%）及无规则卷曲（39.52%）。实时荧光定量PCR分析结果表明,ACSS2基因在不同泌乳时期均有表达,其中在泌乳中期表达量最高,在干奶期表达量最低。本试验结果为进一步研究山羊ACSS2基因在脂质代谢过程中的功能及转录调控机制提供了参考。     

水牛ABCD基因家族生物信息学分析及ABCD1基因表达研究

为鉴定水牛ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运蛋白D （ABCD）基因家族成员及其在水牛中的表达,本研究利用生物信息学对水牛ABCD基因家族的染色体定位、基因结构、保守结构域、蛋白理化性质进行分析,利用实时荧光定量PCR检测ABCD1基因在水牛各组织及不同泌乳期乳腺中的表达,并用3种激素处理水牛乳腺上皮细胞,检测激素对ABCD1基因表达的影响。结果显示,从水牛全基因组中共鉴定出9个ABCD家族基因,分别为ABCD1、ABCD2、ABCD3、ABCD4,其中ABCD4基因包含6个不同转录本（ABCD4X1-ABCD4X6）,ABCD1~ABCD4 4个基因分别位于X、4、6、11号染色体;序列分析发现,ABCD家族基因包含9~22个内含子,编码444~741个氨基酸,分子质量为49.63~83.41 ku,等电点为6.43~9.64;共找到ABC_membrane_2、Endonuclease_5、ABC_tran 3个ABCD家族基因所共有的功能基序。ABCD基因家族可分为4个亚族,系统进化树显示,ABCD基因高度保守。共线性分析表明,水牛和奶牛之间存在7对直系同源的ABCD家族基因。不同组织定量表达结果表明,ABCD1基因在水牛15个组织中均有表达,其中在脂肪组织中表达量最高。不同泌乳时期的乳腺组织定量表达结果显示,ABCD1基因在50 d表达量达到最高,整个泌乳期呈现低-高-低表达模式。用不同浓度催乳素、雌二醇、孕酮分别处理水牛乳腺细胞,当催乳素、雌二醇和孕酮浓度分别达到2.0、0.3和4.5 μg/mL以上时,ABCD1基因表达量显著高于对照组。结果表明,水牛ABCD基因家族包含9个基因,其中ABCD1基因参与泌乳调控,本研究为进一步探讨ABCD家族基因在水牛乳腺中的功能提供了参考依据。     

鸭疫里默氏杆菌CAMP基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在克隆鸭疫里默氏杆菌协同溶血素蛋白(cooperative hemolysin protein,CAMP)基因,并对其进行原核表达和生物信息学分析。以RA贵州血清2型分离株RA-SS-8基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌CAMP基因,构建pET-28a-CAMP重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,重组菌用IPTG进行诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用相关生物信息学分析软件对CAMP基因进行分析。结果显示,鸭疫里默氏杆菌CAMP基因大小为1 026 bp,该基因序列与GenBank中公布的10株RA参考菌株(如RA-LZ01(CP045564.1))CAMP基因的相似性达99.7%。经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后,获得大小约5 369和1 026 bp的基因片段,表明pET-28a-CAMP重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,表达的重组蛋白大小约为37 ku,以可溶形式进行表达,且能与His-tag单克隆抗体在37 ku处产生特异性反应,与预期结果相符。生物信息学分析表明,CAMP蛋白分子式为C₁₆₇₀H₂₆₅₉N₄₃₇O₅₀₀S₁₂,含341个氨基酸,理论等电点(pI)为5.62,不稳定系数为40.71,表明其为不稳定的弱酸性蛋白。疏水性预测结果显示,该蛋白属于亲水性蛋白。CAMP蛋白无跨膜结构域,无信号肽,有3个O-糖基化位点,无N-糖基化位点,存在34个磷酸化位点,共有17个抗原表位。二级结构和三级结构预测结果显示,CAMP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。本试验结果为进一步研究鸭疫里默氏杆菌CAMP蛋白的功能及鸭疫里默氏杆菌病疫苗的研发提供了参考。     

牛坏死杆菌的43 ku外膜蛋白在其黏附细胞中的作用初步分析

旨在明确牛坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)的43 ku外膜蛋白(43K OMP)在其黏附细胞中的作用，本研究将重组43K OMP蛋白和天然43K OMP蛋白与鼠乳腺上皮细胞共孵育，通过免疫荧光方法观察牛坏死杆菌43K OMP对鼠乳腺上皮细胞的黏附作用；同时利用天然蛋白竞争试验和抗体抑制试验明确43K OMP是否介导牛坏死杆菌与细胞的黏附，进一步利用牛坏死杆菌43K OMP基因缺失菌，评价43K OMP基因缺失对牛坏死杆菌黏附力的影响，阐明43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中的作用。免疫荧光试验结果显示：天然43K OMP和重组43K OMP均能黏附于鼠乳腺上皮细胞表面，天然43K OMP与鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞预孵育后，牛坏死杆菌黏附数量明显下降(P＜0.05)；牛坏死杆菌与43K OMP多抗或单抗预孵育后，黏附于鼠乳腺上皮细胞或鼠肝细胞的牛坏死杆菌数量显著降低(P＜0.05)；与牛坏死杆菌A25菌株相比，基因缺失菌A25Δ43K OMP黏附宿主细胞能力极显著下降(P＜0.01)，黏附率分别降低了94.4%和90.4%。因此，43K OMP在牛坏死杆菌黏附细胞中发挥关键性作用，深入研究其黏附机理将为揭示牛坏死杆菌致病机制提供理论基础。     

Characteristics of Rabbit Transgenic Mammary Gland Expressing Recombinant Human Factor VIII

The objective of this research was to compare (i) the content of milk protein and recombinant human factor VIII (rhFVIII) in the milk of transgenic and non-transgenic rabbit females at three lactations and (ii) histological structure, ultrastructural morphology and occurrence of apoptosis in rabbit transgenic and non-transgenic mammary gland during third lactation and involution. Significant differences (t_0.05) in milk protein content were found between transgenic and non-transgenic at all three lactations. The percentage of apoptotic cells was significantly higher (t_0.01) in non-transgenic ones compared with transgenic mammary gland tissues (6.5% versus 2.4%) taken at the involution stage. Morphometrical analysis of histological preparations at the involution stage detected a significantly higher (t_0.05) relative volume of lumen in transgenic animals compared with non-transgenic ones (60.00 versus 46.51%). Ultrastructural morphology of the transgenic mammary gland epithelium at the involution stage revealed an increased relative volume of protein globules (t_0.05); at the lactation stage, a significantly higher volume of mitochondria (13.8%) compared with the non-transgenic (9.8%) ones was observed. These results, although revealing differences in some parameters of ultrastructure and histology, indicate no harmful effect of the mouse whey acid protein-hFVIII transgene expression on the state of mammary gland of transgenic rabbit females.     

鼠伤寒沙门菌cya基因的克隆表达及生物信息学分析

研究旨在克隆鼠伤寒沙门菌cya基因并对其进行生物信息学分析。以鼠伤寒沙门菌SL1344株为模板PCR扩增并克隆了鼠伤寒沙门菌cya基因,构建原核表达质粒pET-32a-cya,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用1 mmol/L IPTG对其进行诱导表达、纯化,同时利用相关的生物信息学软件对其进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌cya基因大小为1 185 bp。经SDS-PAGE和Western blotting分析显示,在原核表达系统中主要以包涵体形式存在,蛋白分子质量大小约为58 ku。生物信息学分析表明,Cya蛋白由394个氨基酸组成,理论分子质量为44.97 ku,分子式为C₂₀₂₆H₃₁₄₆N₅₆₂O₅₇₈S₁₁,等电点（pI）为7.01,其中带负电荷残基总数（Asp+Glu）43个,带正电荷残基总数（Arg+Lys）42个。Cya蛋白无信号肽与跨膜区,为膜内蛋白,含有4个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、27个磷酸化位点、13个线性B细胞结合位点、11个T细胞结合位点。二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为38.07%、19.80%、5.58%和36.55%。本试验结果为进一步研究鼠伤寒沙门菌Cya蛋白的功能及建立以Cya蛋白为抗原的免疫鉴别检测方法奠定了基础。     

槟榔江水牛OXCT1基因的分子特征及组织表达谱分析

本研究对槟榔江水牛3-酮酸辅酶A转移酶1（3-oxoacid CoA-transferase 1,OXCT1）基因的完整CDS区进行了PCR扩增,并对其功能生物信息学和多组织差异表达进行了分析。以普通牛OXCT1基因序列（GenBank登录号：XM_006076397）为参考序列,采用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,以提取的槟榔江水牛基因组DNA为模板,PCR扩增获得槟榔江水牛OXCT1基因mRNA序列,扩增产物经测序后利用ORF Finder软件进行开放阅读框识别,获得水牛OXCT1基因CDS区全序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,槟榔江水牛OXCT1基因CDS序列全长1 563 bp,编码520个氨基酸,蛋白分子式为C₂₅₀₉H₄₀₄₁N₆₈₇O₇₄₆S₂₃,分子质量为56.50 ku,理论等电点（pI）为8.69,不稳定系数为27.49,平均疏水性（GRAVY）为-0.097,该蛋白属弱亲水性蛋白。OXCT1蛋白无信号肽和跨膜结构,属于线粒体膜蛋白;包含pcaJ_scoB_fam和AtoD 2个保守结构域,且具有5个功能活性位点。槟榔江水牛与普通牛、藏羚羊等5个物种的OXCT1氨基酸序列同源性≥ 97%。对槟榔江水牛13个组织进行表达谱分析表明,在泌乳期,OXCT1基因在乳腺中表达量最高,在肾脏、垂体、脂肪、大脑、皮肤和肌肉中不表达;在非泌乳期,OXCT1基因在除脂肪以外的其他12个组织中都有表达。OXCT1基因在槟榔江水牛泌乳期乳腺组织中表达量最高,推测其可能参与了水牛的乳脂合成调控事件。本研究结果可为深入了解乳脂合成代谢及其调控机制提供依据。     

关中奶山羊FGF2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】对关中奶山羊成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）基因进行克隆及生物信息学分析，并检测其在山羊各组织中的表达差异，为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】以关中奶山羊乳腺cDNA为模板，采用RT-PCR技术扩增并克隆关中奶山羊FGF2基因完整CDS区序列，进行相似性比对、系统发育树构建及生物信息学分析；运用实时荧光定量PCR方法检测FGF2基因在关中奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢组织中的表达情况。【结果】关中奶山羊FGF2基因编码区长468 bp，可编码155个氨基酸，分子质量为17.26 ku，理论等电点为9.58，其中含量最高的是甘氨酸，占10.3%。相似性比对结果表明，关中奶山羊FGF2氨基酸序列与人、牛、马、兔、绵羊、虎鲸和野猪的相似性分别为98.7%、99.4%、100.0%、98.7%、99.4%、99.4%和62.6%。系统进化树显示，FGF2基因在不同物种间具有高度保守性，与马的亲缘关系最近。关中奶山羊FGF2蛋白不稳定指数为38.39，属于稳定亲水性蛋白质，不含跨膜结构和信号肽；FGF2蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲，分别占比10.32%、14.19%、30.97%、44.52%。蛋白质互作预测分析显示，FGF2蛋白与FGFR、KDR、FGF1、FGFR4、MET和FGFR1等与乳腺生长发育相关的蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR检测到关中奶山羊FGF2基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢中均有表达，在乳腺中表达水平最高，其次为卵巢，在背最长肌中的表达水平最低。【结论】关中奶山羊FGF2基因CDS区序列长468 bp，编码155个氨基酸，为亲水蛋白，二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。FGF2基因在关中奶山羊泌乳高峰期的不同组织中均有表达。本试验结果为进一步探究FGF2基因在关中奶山羊乳腺发育中的作用及其具体功能提供了参考。     

水牛PNPLA8基因编码区克隆、表达分析及催乳素对该基因的调节作用

为了探究磷脂酶patatin样域包含蛋白8（patatin-like phospholipase domain containing 8,PNPLA8）在水牛乳腺脂质代谢中的作用,试验根据GenBank中公布的奶牛PNPLA8基因序列（登录号：XM_005205444.4）设计引物,应用PCR扩增并克隆水牛PNPLA8基因编码区（CDS）,应用生物信息学软件分析序列及蛋白质结构;抽提水牛不同组织及不同泌乳期乳腺组织RNA,利用实时荧光定量PCR检测PNPLA8基因在不同组织间和不同泌乳期的表达;利用不同浓度的催乳素处理水牛乳腺上皮细胞,通过定量检测催乳素对PNPLA8基因表达的影响。结果显示,水牛PNPLA8基因CDS长2 355 bp,编码784个氨基酸,与牦牛、山羊等PNPLA8基因具有较高的同源性;PNPLA8基因在所检测的水牛11个组织中有不同水平的表达,在肺脏和乳腺中表达量相对较高,在脂肪和肌肉组织中表达量较低;在整个泌乳期内PNPLA8基因的表达呈现"低-高-低"趋势;催乳素处理水牛乳腺上皮细胞结果显示,随着催乳素浓度升高,PNPLA8基因表达量逐渐下降。本研究成功克隆了水牛PNPLA8基因,并发现PNPLA8基因是参与乳腺泌乳的一个功能基因,为进一步研究PNPLA8基因在水牛乳腺中的功能奠定基础。