利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT~-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT~-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT~-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT~-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。     

利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。     

CRISPR/Cas9介导的绵羊胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素基因敲除研究

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因突变可引起动物出现"双肌"性状,提高产肉性能。利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除的绵羊胎儿成纤维细胞,为制备MSTN基因敲除羊提供材料。设计构建4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,脂质体转染细胞后,通过SURVEYOR分析和测序等方法对敲除效率进行检测,采用极限稀释法挑选稳定敲除的细胞系。试验成功构建了4个靶向MSTN基因的CRISPR/Cas9载体,细胞转染后,测序结果显示pX330-target 1和pX330-target 4载体作用的靶位点处出现突变,SURVEYOR分析检测其在靶位点产生切割的效率分别为24.20%和10.18%。通过极限稀释法,获得12个MSTN基因突变的细胞克隆,其中1个为纯合突变。序列比对发现靶位点处有小片段碱基插入或缺失突变,部分会出现移码突变。成功利用CRISPR/Cas9系统实现了绵羊MSTN基因敲除,证明该系统可有效应用于绵羊基因编辑,产生的突变细胞系为制备MSTN基因敲除羊提供了材料。     

大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及验证

根据大肠杆菌W3110菌株的waaL基因序列设计CRISPR/Cas9的作用靶点,构建sgRNA表达质粒,然后设计同源修复供体DNA序列,通过电转化法导入宿主菌内,从而构建完整的大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统.结果显示,应用该系统成功地构建了大肠杆菌waaL基因缺失株.将该系统继续用于大肠杆菌W3110菌株...     

猪源产肠毒素大肠杆菌三重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)检测方法,根据产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88)和毒素(STa和LT)基因分别设计合成了1对引物,对K88、STa和LT基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、STa和LT的三重PCR方法。该方法对K88、STa和LT基因的扩增产物分别为499 bp,190 bp和373 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的三重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的三重PCR方法对实验室从临床腹泻样品中分离的120株大肠杆菌进行检测,结果 9株为K88/LT/STa阳性,14株为K88/LT阳性,21株K88/STa阳性,13株LT/STa阳性,8株K88阳性,2株LT阳性,12株STa阳性。     

CRISPR/Cas9技术在猪、鸡中的应用研究进展

基因编辑是利用核酸酶在基因组的特定位点产生DNA双链断裂，从而触发细胞自身的DNA损伤修复机制，实现对靶基因序列进行位点特异性修饰。规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）及其相关蛋白9（Cas9）系统作为第3代基因编辑技术在农业和基因治疗研究中发挥着重要作用，与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比，它可以靶向基因的任何位点引起DNA双链断裂，实现目标基因的精准敲除或插入外源片段，并能快速、高效地修饰基因组，包括基因敲除、敲入、抑制、激活等，是应用最广泛的基因编辑工具。CRISPR/Cas9技术的出现彻底改变了生命科学、医学和遗传学研究现状。近年来，利用CRISPR/Cas9技术对动物基因组进行修饰，开启了畜禽分子育种的新纪元，不仅极大地推动了现代畜禽养殖技术的发展，而且为人类医学研究做出了特殊贡献，特别是在猪和鸡上。作者以猪和鸡为对象，综述了CRISPR/Cas9技术在异体器官移植供体、人类疾病的生物模型、抗病育种材料、全基因组高通量筛选等方面的研究进展，以及如何利用CRISPR技术快速又简单地生产出基因编辑猪、鸡，为推动CRISPR技术制备其他基因编辑动物提供参考依据。     

运用CRISPR/Cas9系统编辑细菌基因的研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins 9)系统来源于细菌的适应性免疫防御系统,能通过RNA指导的Cas9核酸酶特异性剪切靶标基因。相比于细菌同源重组编辑系统,CRISPR/Cas9系统在细菌的基因编辑中已展现出独特的优势:操作简便、较高的编辑效率、特异性、可以同时编辑多个靶基因或删除基因簇片段且不对基因组产生任何"伤疤"。虽然这种操作系统还没有达到在真核生物中的成熟应用程度,但目前CRISPR/Cas9系统在编辑细菌基因上已取得了一些重要进展,现将对这些进展进行总结与分析。     

利用CRISPR/Cas9技术对鸡AMHR2基因进行精确编辑

为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0%,并在鸡DF-1细胞基因组上实现了AMHR2基因的精确编辑。     

λ-Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞毒素stx2基因

采用PCR法合成了stx2基因上游和下游的2个同源臂序列分别为1635,1655bp。2个同源臂序列被克隆到载体pCR2.1-TOPO上,两臂中间插入庆大霉素抗性基因Gm(855bp),构建了stx2基因敲除盒子pCR2.1-B-Gm-A。将含2个同源臂和Gm抗性基因片段的扩增子电转化到含质粒pKM208的感受态细胞EHECO157:H7中,通过λ-Red重组系统产生了stx2基因敲除突变菌株。用Verocell试验检测了突变株的产毒能力并进行了细胞黏附试验。结果表明,合成同源臂利用λ-Red重组系统可以有效的敲除EHEC毒素基因,stx2基因敲除后的突变株不产stx2毒素,对真核细胞CaCo-2和Hep-2的黏附能力明显降低。     

浅谈基因编辑技术与猪遗传改良

近年来,CRISPR/Cas基因编辑技术（主要包括CRISPR/Cas9及其同源蛋白、单碱基编辑及基因表达调控技术）的发展和应用在动物功能基因研究和遗传性状改良上都取得了重要突破。文章主要通过围绕CRISPR/Cas系统,重点阐述了CRISPR/Cas9及其衍生的基因编辑新技术的结构、作用机制差异及在猪遗传育种中的应用,并对目前该系统存在的问题及系统优化方法进行分析。     

家禽疱疹病毒CRISPR/Cas9基因编辑最新研究进展

基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑是最新一代的基因组编辑技术，在向导RNA （gRNA）的介导下几乎可以靶向编辑任何一种基因，实现基因组的定点突变、敲除或插入。近年来将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大基因组DNA病毒的研究，尤其是用于疱疹病毒的基因编辑已成为病毒学研究领域的最新国际热点。自2016年首次报道利用CRISPR/Cas9系统改造家禽疱疹病毒如马立克病病毒（MDV）基因组以来，短短5年时间已全面应用于家禽疱疹病毒的蛋白编码基因和非编码RNA基因的编辑、基因缺失疫苗和重组疫苗研发、抗病毒治疗以及抗病育种等领域。本文详细综述了当前CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽疱疹病毒中的应用进展和最新成果，并对其面临的问题和前景进行了展望，以期为后续研究提供重要参考。     

CRISPR/Cas9系统在猪基因编辑中的研究进展

随着基因编辑技术不断发展,从最初的同源重组到现在的CRISPR系统,基因编辑的操作步骤得到简化,编辑效率得到提高且降低了成本。CRISPR/Cas9系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑,CRISPR/Cas9技术操作简单、定位准确,近年来被广泛使用。本文主要介绍CRISPR/Cas9系统,并对该系统在猪遗传改良、抗病育种、构建人类疾病模型及异种器官移植4个方面的应用研究进行综述。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术原理及其在牧草中的应用

CRISPR/Cas9系统是一种新型RNA靶向的基因编辑系统。在近几年的研究中, CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展十分迅猛, 因其具有经济、高效、简便的特点而广泛应用于育种、医疗、工业等领域。介绍了2种新型基因编辑技术, 阐述了CRISPR/Cas9的结构、功能以及CRISPR/Cas9基因编辑技术原理, 综述了该技术在牧草中的应用研究进展, 以期为利用CRISPR/Cas9系统研究牧草基因功能及改良牧草性状提供思路。     

CRISPR/Cas9基因敲除研究进展

功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步,基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。基因敲除手段种类繁多,其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术,具有高效、便捷、精确等优点,在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。随着科研工作的逐渐深入,CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用,为科研工作的开展提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究进展

利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修饰提供了一条更直接的途径,主要由于这些酶能直接在DNA序列上进行一步式的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)是一种RNA导向的DNA内切酶,精准定位于特定的靶位点,高效完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9技术作为精准而强大的第3代基因组编辑工具,已经成功应用于猪、牛、山羊、绵羊和鸡上,这些CRISPR/Cas9基因编辑畜禽可作为研究人或畜禽生理和病理的生物模型、生产功能性蛋白质的生物反应器或器官移植的供体。特别是在畜禽生产方面,CRISPR/Cas9基因编辑可用于改善生产遗传特性及畜产品质量,提高畜禽对疾病的抵抗力。作者对当前畜禽中特定位点基因组修饰的CRISPR/Cas9技术的原理及基因组编辑在畜禽育种中应用的最新进展进行了综述,以期为推进CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究提供参考。     

单碱基编辑技术及其在动物育种中的应用研究进展

单碱基编辑技术是以CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统为基础衍生出的能够对基因组进行精确定点编辑的一项新技术。与CRISPR/Cas9技术系统不同,单碱基编辑系统通过在双链造成单切口后对碱基进行单碱基的替换,有效解决CRISPR/Cas9基因编辑系统双链断裂易产生片段插入或者缺失的缺陷,提高单碱基编辑的精确性及效率。本文介绍了胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine BaseEditor）、腺嘌呤碱基编辑器（AdenineBaseEditor）以及最新的引导编辑系统（PrimeEditing）的建立过程、原理、优缺点及其在动物育种中的应用,并对单碱基编辑技术发展进行展望。     

基于CRISPR/Cas9技术的法尼醇X受体缺失株的构建及其对HeLa细胞增殖的影响

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体（FXR）基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D_{595 nm}值极显著低于野生型HeLa细胞孔（P<0.01）,说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

浙江省猪源产肠毒素大肠杆菌分子流行病学调查

本研究旨在调查浙江省猪源产肠毒素性大肠杆菌的流行情况和毒力基因特征。采用标准细菌学方法对大肠杆菌进行分离,并用聚合酶链反应(PCR)方法检测大肠杆菌的毒力基因。2014-2021年共分离到137个携带ETEC黏附素或肠毒素基因的大肠杆菌菌株,其中禁抗后平均每年分离到的菌株数量是禁抗前的2倍。肠毒素基因检测结果表明,STb (129/137,94.2%)最常见,其次是STa (64/137,46.7%)和LT (62/137,45.3%);黏附素基因以F18 (56/137,40.9%)最占优势,其次为K88 (28/137,20.4%),未检测到K99和987P及F41等黏附素。上述137个临床分离株中共检测到16种不同的毒力因子模式,平均每8.6个菌株产生一种不同的毒力因子模式;其中39.4%的菌株仅携带肠毒素基因,检测不到经典的黏附素基因,而1.5%的菌株则与之相反。共有81株菌同时检测到肠毒素和黏附素基因,占检出总数的59.1%。在所有被检测的生长阶段,肠毒素STb均为检出率最高的肠毒素,且随着日龄增加检出率逐渐降低。黏附素F18随着仔猪日龄的增加检出率不断提高;K88黏附素在各...     

CRISPR/Cas9系统介导的一步法胚胎注射获得猪GGTA1敲除胚胎

利用CRISPR/Cas9系统介导的一步法注射方式,对猪1-细胞期孤雌胚胎进行注射来获得GGTA1基因敲除胚胎,同时对胚胎发育过程进行跟踪,探索CRISPR/Cas9系统介导猪基因敲除效率和对胚胎发育的影响。结果表明,与对照组相比,利用CRISPR/Cas9系统一步法制备基因敲除胚胎,对卵裂率、囊胚率等胚胎发育指标方面无显著影响;利用T7内切酶I检测发现,GGTA1基因突变率约为28.07%;测序发现,突变类型包括插入型突变以及插入-删除型突变。说明CRISPR/Cas9系统介导的一步法能够高效快速地实现基因敲除且不影响早期胚胎发育。     

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因敲除的猪回肠上皮（immortal pig intestinal-2I,IPI-2I）细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体（pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5）共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞（片段敲除效率为15.5%）,其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。