紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶(squalene epoxidases,SQE)是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶(MsSQE1)基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA3条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA3的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高;GA3(50μmol·L~(-1))和ABA(100μmol·L~(-1))处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

东方泽泻实时荧光定量PCR内参基因的筛选及AoSS基因的组织表达特性分析

[目的]筛选适用于东方泽泻实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的内参基因,并分析其鲨烯合酶基因(AoSS)的表达特性,为后续研究东方泽泻原萜烷型三萜生物合成调控及诱导机制打下基础.[方法]从东方泽泻转录组中选取内参基因18S rRNA、EF1α、GAPDH、ACT、UBQ和UBC,应用qRT-PCR检测其在不同组织和激素处理下的表达情况,并借助Delta CT、GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder对其表达稳定性进行分析评价.以筛选到的内参基因分析AoSS基因在不同组织中的表达情况.[结果]18S rRNA、GAPDH和EF1α基因在东方泽泻不同组织的表达稳定性较高,但18S rRNA、UBC和EF1α基因在不同激素处理下的表达稳定性均较高.以18S rRNA、GAPDH和EF1α基因为内参分析AoSS基因在东方泽泻不同组织中的表达量情况,结果显示,AoSS基因在东方泽泻不同组织中均有表达,其表达情况基本一致,均在东方泽泻块茎中表达量最高,其次是叶柄和叶,而在根中表达量最低.[结论]18S rRNA、GAPDH和EF1α基因是研究东方泽泻不同组织中基因表达分析的首选内参基因;18S rRNA、EF1α和UBC基因是研究激素处理下基因表达的首选内参基因.AoSS基因的表达具有组织特异性,其可能在东方泽泻的生长发育中发挥重要的调控功能.     

UV-B胁迫下紫花苜蓿qRT-PCR内参基因的筛选

[目的]在植物代谢通路关键调控基因表达的相关研究中,筛选各种条件下合适的内参基因至关重要。[方法]以UV-B为主要胁迫,运用荧光定量PCR技术以及geNorm和NormFinder软件,对不同取样时间（处理后0、1、2和5d）的紫花苜蓿（MedicagosativaL.）幼苗根、茎、叶组织中Actin2、GAPDH、MSC27、18SRNA、β-tublin、bZIP、UBQ、PPPrep、Ms03₅0f03和Ms03₆9f07等候选内参基因表达的稳定性进行研究。[结果]geNorm软件显示:紫花苜蓿幼苗根部UV-B胁迫下MSC27和UBQ的稳定值（M）较小,增加第3个内参基因后变异值（V）基本不变,表明选用2个内参基因即可;茎部则是MSC27和Actin2的M值较小,同时相应的V值也满足要求;而使用M值较小的Actin2和GAPDH为内参,在研究叶片基因表达时可以获得更加准确的结果,当增加第3个内参基因时,V值变大,反而影响结果。同时发现,18SRNA和β-tublin在根和茎叶中的稳定性均较差,因此不适宜作为内参基因使用。NormFinder的结果与上述结果相似,结果差异部分的原因可能是因为算法不同。[结论]在UV-B胁迫下,紫花苜蓿幼苗根部中MSC27和UBQ的表达较为稳定,而在茎部则以MSC27和Actin2为宜,使用Actin2和GAPDH为内参在研究叶片基因表达时可以获得更加准确的结果。本研究对UV-B胁迫下紫花苜蓿中关键基因的定量表达分析具有重要的实用价值。     

蝙蝠TRAIL基因的克隆·表达及生物学功能分析

[目的]克隆蝙蝠TRAIL基因,构建蝙蝠可溶性TRAIL原核表达栽体,研究其对肿瘤细胞凋亡的影响.[方法]通过RT-PCR技术克隆蝙蝠TRAIL的全长cDNA序列,实时荧光定量PCR鉴定其组织分布,将其可溶性片段与表达载体pET43.1a连接,并在大肠杆菌BL21中高效表达和纯化,通过western blotting证实.体外,通过MTT、TrypanBlue和流式细胞术检测纯化的可溶性TRAIL蛋白能否诱导肿瘤细胞的凋亡.[结果]成功克隆蝙蝠TRAIL基因,构建了重组表达载体,获得可溶性TRAIL蛋白.体外试验证明,可溶性蝙蝠TRAIL蛋白能够诱导Jurkat细胞和HeLa细胞的凋亡.[结论]可溶性蝙蝠TRAIL蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡,该研究为蝙蝠免疫系统的研究奠定了基础.     

绵羊 PGRMC1 蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t孕激素受体膜组分1 (PGRMC1)在动物繁殖活动中有重要调节作用,本研究旨在探讨牦牛PGRMC1基因的序列及其在生殖轴的组织表达特性。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t试验采集5头牦牛和5头黄牛的下丘脑、脑垂体、卵巢、输卵管和子宫,以GenBank上已发布的普通牛PGRMC1基因序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆牦牛和黄牛的PGRMC1基因,并使用相关的生物信息学软件对克隆所得序列进行分析;采用qRT-PCR法检测该基因在牦牛和黄牛不同组织中的表达情况。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t结果得到牦牛和黄牛PGRMC1基因cDNA序列(GenBank登录号：MF803753 和MF803754),编码区(CDS)全长都为585 bp,编码 194 个氨基酸。其编码蛋白中含有1个 Cyt-b5 保守结构域。qRT-PCR结果表明：PGRMC1基因在牦牛和黄牛下丘脑、脑垂体、卵巢、输卵管和子宫都有表达,牦牛和黄牛的垂体中的PGRMC1的表达差异显著(P<0.05),但在其他组织品种间差异不显著;牦牛PGRMC1在卵巢和垂体的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t本研究提示PGRMC1基因可能在牦牛卵泡发育、发情、排卵等繁殖机能调控中发挥重要作用。\t\t\t\t\t\t\t\t\t     

雌雄驯鹿茸皮组织ENO1基因cDNA克隆与表达

选用雌、雄驯鹿(Rangifer tarandus)顶端茸皮组织为试验材料,参考Genebank数据库中白尾鹿(Odocoileus virginianus)、牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)等同源物种的ENO1基因序列设计同源引物,采用PCR及T-A克隆技术以雄性驯鹿茸皮组织为材料克隆ENO1基因的c DNA序列,并运用荧光定量PCR技术对ENO1基因在雌、雄驯鹿茸皮组织中的表达量进行对比分析。结果表明:成功克隆获得驯鹿ENO1基因,其编码区片段大小为1 305 bp,共编码434个氨基酸;ENO1基因编码的蛋白的相对分子质量为47 342.09,其二级结构以α-螺旋为主;Blastp比对显示,驯鹿ENO1基因与羊、白尾鹿、牛的同源性最高,均为99%。构建系统进化树发现,驯鹿ENO1基因与白尾鹿的亲缘关系最近,与白头鹰(Haliaeetus leucocephalus)的亲缘关系最远;荧光定量PCR结果显示,ENO1基因在茸皮组织中的表达量在雌、雄之间存在差异,其中在雄性驯鹿茸皮组织中的表达量是雌性驯鹿茸皮组织中的(3.35±0.12)倍。     

产酶溶杆菌rpfG基因的克隆与功能分析

为探索基因rpfG在产酶溶杆菌中的功能,以产酶溶杆菌OH11为研究对象,在基因组测序的基础上,通过同源比对,在OH11基因组中鉴定出rpfG的同源基因,并命名为rpfGLys。利用同源重组技术,对rpfG基因进行了定向敲除,获得了rpfG的缺失突变株。与野生型相比,rpfG基因的突变降低了产酶溶杆菌重要抗菌物质———热稳定抗菌因子HSAF的产量和对腐霉的拮抗活性。荧光定量PCR显示,在rpfG突变株中负责生物合成HSAF的关键基因Lysegl002651的表达显著下调,与HSAF活性检测结果相吻合。然而,rpfG的突变不改变产酶溶杆菌4种胞外抗菌水解酶的活性。另外,rpfG突变导致产酶溶杆菌菌落表面干燥,但滑行能力提高。     

杨树PsChiⅠ基因全长的克隆与表达分析

【目的】克隆川杨几丁质酶基因cDNA全长序列,分析其在病原菌侵染过程中不同时段的表达特征。【方法】以受落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)单孢子堆菌系Sb052侵染后的川杨叶片为试材,采用RACE法克隆川杨几丁质酶基因cDNA序列,对其进行生物信息学和实时荧光定量表达分析。【结果】克隆到1条川杨几丁质酶基因序列,将其命名为PsChiⅠ(GenBank登录号:KC416180)。该序列全长1 145bp,包含1段960bp的开放阅读框(ORF),38bp的5′非编码区和147bp的3′非编码区。其编码蛋白含有319个氨基酸,具有2条糖苷水解酶19家族特征序列,理论等电点为5.03,为ClassⅠb型酸性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。序列比对和系统进化树结果表明,PsChiⅠ与毛果杨(Populus trichocarpa)几丁质酶基因相似性最高,且亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,菌系Sb052侵染杨树叶片后PsChiⅠ基因在各个时段都有表达,但以侵染后12和48h时的表达量相对较高。【结论】获得了几丁质酶基因全长序列,推测其参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制。     

不同日龄鸭肝脏中IGF-1及IGF-1R基因表达规律的研究

为明确鸭肝脏胰岛素样生长因子1(IGF-1)及IGF-1受体(IGF-1R)基因mRNA表达的发育性变化规律,选择0、14、28、42和56日龄高邮鸭和金定鸭各10只(共100只),称测体重后屠宰,采集肝脏组织,采用实时荧光定量PCR法检测IGF-1和IGF-1R基因的发育性变化,并进行品种间比较。结果表明:0～56日龄期间,高邮鸭和金定鸭肝脏IGF-1基因表达量均呈先升后降的趋势,56日龄时高邮鸭肝脏IGF-1基因表达量极显著高于金定鸭;IGF-1R基因表达量基本呈下降趋势,高邮鸭肝脏IGF-1R基因表达量在0日龄时显著高于金定鸭。高邮鸭和金定鸭肝脏IGF-1和IGF-1R基因表达的发育性变化与体重存在不同程度的负相关性。鸭肝脏中IGF-1和IGF-1R基因表达量有特定的发育模式且存在品种差异,IGF-1R基因表达水平的变化不依赖IGF-1基因表达水平。     

小麦耐盐相关基因TaRSTR的克隆与功能分析

高盐是限制植物生长和发育的重要非生物胁迫因子。以耐盐小麦RH8706-49根部基因表达谱芯片结果为基础,利用电子克隆和RT-PCR方法克隆了一个盐胁迫时上调表达的基因,命名为TaRSTR(登录号:EU263918)。荧光定量PCR分析证实该基因受盐胁迫诱导表达,亚细胞定位结果显示TaRSTR蛋白定位在细胞核里。TaRSTR过表达提高了转基因拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率及成年植株的耐受性。TaRSTR基因过表达可显著提高已知耐盐相关基因At FRY1、At P5CS1和AtRD29B的表达量,推测TaRSTR基因通过这些标记基因提高了转基因拟南芥的耐盐性。上述结果表明TaRSTR基因过表达能提高植株的耐盐性,是植物耐盐的正调节子。     

3种苜蓿不同部位皂苷含量的测定研究

[目的]研究3种苜蓿不同部位中皂苷含量的测定。[方法]采用比色法测定了江苏地区苜蓿属3种植物紫花苜蓿（包括5种栽培品种）、天蓝苜蓿和南苜蓿不同部位的总皂苷含量。[结果]紫花苜蓿根中皂苷含量（1.39%）明显高于其他2种苜蓿根中皂苷含量;天蓝苜蓿和南苜蓿茎中皂苷含量差异不明显（RSD=2.4%）,略低于紫花苜蓿茎中皂苷含量（0.583%）;天蓝苜蓿叶中皂苷含量最低（0.623%）。综合3种不同部位的皂苷含量,根中皂苷的平均含量达到1.335%,明显大于茎（0.596%）和叶（0.655%）中皂苷含量。[结论]该研究为进一步开发苜蓿属植物资源提供了一定的理论依据。     

微量元素肥料对紫花苜蓿草产量的影响

采用完全试验设计研究硼、钼、锌对紫花苜蓿草产量和植株高度的影响．结果表明,微量元素硼、钼、锌单独施用可以显著提高苜蓿干草产量和植株高度,其配合施用存在互作,其中钼和硼为正互作,可以显著提高苜蓿干草产量和植株高度;苜蓿植株高度和干草产量存在显著的正相关（r=0．8792）,即苜蓿干草产量的提高可以通过植株高度的增加来实现．     

紫花苜蓿在塔里木河流域的抗寒性研究

对21个引入的国内外紫花苜蓿(MedicagosativaL.)品种进行了抗寒性研究,结果表明,各品种在同一自然条件下,抗寒性指标含量存在差异。与对照品种新疆大叶比较,引进品种中,飞马、驯鹿、牧歌401、阿尔冈金(内)、皇冠、苜蓿王、WL-323、甘农3号、德宝、甘农2号、草原2号和德福在塔里木河流域的抗寒性较强。     

不同紫花苜蓿品种光合性能比较研究

对20种引入的国内外紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种进行了光合性能研究,通过测定叶片的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量,结合鲜草产量进行了分析.结果表明,不同品种在同一地区相同自然条件下,指标含量存在差异.与新疆大叶品种比较后,引进品种以飞马的指标含量最优,其次为德宝、三得力、德福、驯鹿、中苜1号、皇冠、苜蓿王、雷达克之星,它们的光合性能和产量均优于对照品种,适于在塔里木河流域种植.     

低pH对苜蓿共生结瘤与生长的影响研究

研究了低pH条件对苜蓿生长和结瘤的影响。结果表明:与对照(pH6.5)相比,pH4.5处理极显著地抑制苜蓿初生根的伸长和根瘤菌Rhizobium meliloti的生长,进而抑制共生结瘤和苜蓿植株的生长。低pH并不直接影响苜蓿根毛变形,导致根毛变形率下降的根本原因在于根瘤菌受到低pH抑制。     

氮、磷、钾肥料配施对紫花苜蓿产量的影响

采用不完全试验设计,在温室对花盆种植的苜蓿施用氮、磷、钾肥料,研究其对牧草干物质产量的影响．结果表明：用种子播种所建植的苜蓿,在播种当年追施氮、磷、钾肥可以显著（p〈0.05）提高苜蓿干草产量和植株高度,且随着氮肥施入量的增加,干草产量呈上升趋势;磷、钾、肥以中等施入量（120kg P2O5／hm^2,200kgK2O／hm^2）增产效果较好．     

有机酸-磷配施对紫花苜蓿生长及磷锌吸收的影响

采用田间试验方法,研究了在锌同一施用量条件下,有机酸-磷配合施用对紫花苜蓿生长及对磷锌元素吸收的影响.结果表明,施磷肥和有机酸(富啡酸)可显著提高苜蓿鲜草产量,且产量随施磷量的增大而增大,其中P2FA2处理年鲜草产量达到最大值57.43 t.hm-2;各茬苜蓿中磷含量均随施磷量的增加有先升后降的趋势,均以P1FA1,P1FA2处理的磷含量最高,但并不随FA施用量的增加而增加;苜蓿体内锌含量随施肥量的不同并无明显变化规律.     

不同浇水处理下苜蓿丰产技术的研究

采用完全随机实验设计，对新牧1号杂花苜蓿适宜浇水时期、浇水次数及浇水量进行研究，结果表明：不同浇水处理对提高新牧1号杂花苜蓿干草产量有一定的影响，各试验处理间表现出显著差异（P〈0．05）；浇水时期中以刈割前5天浇水增产效果最好，干草产量比对照提高25．67％以上，且浇水处理增大了苜蓿干草中茎杆比例；浇水次数可以提高干草品质，且以浇二水处理效果较好，产量比对照提高18．94％以上；浇水量中以1130m^2／hm^2的处理干草产量最高，比对照提高24．92％。     

宁夏不同地区紫花苜蓿的营养成分分析

[目的]研究紫花苜蓿营养成分对畜牧业发展具有积极作用。[方法]对宁夏9个不同产地的陇东紫花苜蓿营养成分进行比较,并利用灰色关联理论和层次分析法进行了综合评价。[结果]盐池县的紫花苜蓿在供试样品中养分总体表现最好,其次为贺兰山农牧场等地区的紫花苜蓿,最后为永宁县等地区的紫花苜蓿。[结论]不同产地的紫花苜蓿在养分含量上存在差异,应根据养分含量来选择不同产地的紫花苜蓿。     

苜蓿与红豆草体细胞杂交的研究及条件

无臌胀病苜蓿品种的育种计划的可能突破口,是利用生物技术把单宁基因导入到紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中去。本文首次报道了紫花苜蓿与红豆草(Onobrychis viciifolia Scop.)原生质体融合的可能性和条件,进而将红豆草的单宁基因导入到苜蓿中去。本实验结果证明苜蓿与红豆草的原生质体融合是可能的,通过基因型选择,选择同步分裂的苜蓿和红豆草细胞系,从其悬浮培养细胞系中分离原生质体,将两者混合悬浮在0.1mMCaCl_2 0.6M 甘露醇溶液中(pH5.6),原生质体总密度为3.6×10~5/ml(苜蓿占2.3×10~5/ml,红豆草占1.3×10~5/ml),在1.00～1.25 KV/cm 电场强度下,脉冲次数1～3次,其异核融合细胞频率可提高到26.7～40.9%,并且其异核体仍能较好地分裂,可以分裂2～3次,个别分裂4次,形成小细胞团,但植板率很低,未能持续分裂形成愈伤组织。建议为了提高异核体的植板率,电场强度应低于1.25KV/cm,甚至低于1.00KV/cm,脉冲次数1～2次为宜,以减少电场对细胞的损害。同时提高原生质体培养密度,改良培养条件和方法。如何保证异核体持续分裂和高的植板率是今后研究的关键问题。