花铃期棉花黄萎病抗病与感病品种对土壤细菌群落结构的影响

【目的】研究花铃期棉花黄萎病抗/感品种土壤细菌群落结构,了解抗/感品种土壤细菌群落结构与土壤理化性质之间的关系,为棉花黄萎病的监测与绿色生态防控打下理论基础。【方法】通过田间小区试验,以感病品种(鄂荆1号,EJ)和抗病品种(冀863,J863)为试验材料,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和高通量测序(Illumina MiSeq)技术分别测定花铃期不同阶段(盛花期、开花后期和结铃期)土壤中大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)数量和土壤细菌群落结构,结合冗余分析(RDA)明确细菌群落结构与土壤理化性质的相关性。【结果】棉花黄萎病的发生与土壤中大丽轮枝菌ITS基因拷贝数量存在不同程度的相关性,其中感病品种EJ的发病率和病情指数与土壤中病原菌数量呈正相关,而抗病品种J863的发病率和病情指数与病原菌数量相关性不大。除盛花期外,棉花开花后期和结铃期抗病品种J863土壤中的病原菌数量低于感病品种EJ。高通量测序分析表明,除开花后期,抗病品种J863在盛花期和结铃期的细菌丰富度Chao1和ACE指数均高于感病品种EJ。主成分分析表明,抗/感品种之间及其在花铃期不同阶段的土壤细菌群落结构存在差异。群落组成方面,在门水平上,感病品种EJ的部分优势菌群平均相对丰度低于抗病品种J863,如放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、硝化螺菌门(Nitrospirae)、Patescibacteria和装甲菌门(Armatimonadetes),降低幅度分别为16.38%、4.05%、2.25%、6.58%、7.10%、20.60%和35.78%;在属水平上,感病品种EJ的部分优势菌群平均相对丰度低于抗病品种J863,包括鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、 Bryobacter、 Iamia、 Pseudarthrobacter、芽球菌属(Blastococcus)、红色杆菌属(Rubrobacter)、类诺卡氏属(Nocardioides)、Pontibacter、链霉菌属(Streptomyces)、Gemmatirosa、微单孢菌属(Micromonospora)和Solirubrobacter,下降幅度分别为5.09%、19.41%、13.79%、2.36%、10.78%、34.47%、46.76%、61.84%、52.75%、48.61%、74.79%、9.13%和26.42%。冗余分析(RDA)表明,土壤细菌群落结构受硝态氮(NO_3~--N)、速效磷(AP)、铵态氮(NH_4~+-N)、无机磷(IP)、pH和有机质(OM)指标影响。【结论】土壤中大丽轮枝菌的数量与棉花抗/感品种黄萎病发生的相关性存在差异,感病品种黄萎病的发生程度与土壤中病原菌数量呈正相关。抗病品种在盛花期、开花后期和结铃期土壤的细菌群落结构优于感病品种,并且不同生育时期的优势菌群存在一定程度的差异。土壤中细菌多样性、相对丰度和组成受有机质、pH、氮素类型、速效磷等指标影响。同时,棉花不同生育时期对土壤中细菌群落结构有明显影响。     

西兰花残体还田对棉花黄萎病防治效果及其对不同生育时期土壤细菌群落的影响

【目的】研究土壤中添加西兰花残体(broccoli residues,BR)对棉花黄萎病及不同生育时期土壤细菌群落结构的影响,为棉花黄萎病的绿色生态防控和化学农药的减量施用提供新途径和思路。【方法】通过田间小区试验,分别以西兰花残体还田和不含有西兰花残体(CK)的耕层土壤中播种的棉花为试验对象,监测不同处理的棉花黄萎病的发生动态。采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和高通量测序(Illumina MiSeq)技术分别测定不同时期土壤中大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)DNA拷贝数量和土壤细菌群落,进而分析西兰花残体还田对土壤中病原菌数量变化和土壤细菌群落的影响。采用主成分分析探索西兰花残体还田对不同生育时期土壤细菌群落在门和属水平的结构变化特征与规律。【结果】西兰花残体还田后棉花黄萎病的发病率和病情指数均呈现出下降趋势,且发病高峰时间推迟,在发病高峰期对黄萎病的防治效果达到70.77%,建立了整个生育期内病情指数-时间病程发展曲线,平均防治效果为57.21%。与空白对照相比,西兰花残体还田处理在棉花生长季和非生长季的4个阶段土壤中大丽轮枝菌DNA拷贝数量分别降低了10.96%、11.11%、25.95%和11.25%。高通量测序分析表明,不同生育时期西兰花残体还田处理显著提高了土壤细菌多样性,丰富度指数Chao1均显著上升,ACE指数在播种前期、花铃期和吐絮期显著上升。与空白对照相比,在不同生育时期内,西兰花残体还田后土壤中的放线菌门(Actinobacteria)菌群的相对丰度呈现显著上升。同时研究表明,西兰花残体还田后优势菌群组成在不同生育时期存在差别,在播种前期和苗期,厚壁菌门(Firmicutes)菌群上升为优势菌群;在蕾期和花铃期,蓝藻细菌门(Cyanobacteria)菌群成为优势菌群。主成分分析表明,西兰花残体还田改变了苗期、蕾期、花铃期和吐絮期的细菌群落结构。进一步分析表明,西兰花残体还田显著增加了链霉菌属(Streptomyces)和芽孢杆菌属(Bacillus)菌群的相对丰度。【结论】西兰花残体还田能够有效抑制棉花黄萎病的发生,降低土壤中大丽轮枝菌DNA拷贝的数量,改变土壤细菌群落结构,增加有益微生物的相对丰度,是一种有效控制棉花黄萎病的绿色措施。     

温度对棉花黄萎病发生及寄主防御反应的影响

【目的】解析不同温度对棉花黄萎病发生的影响以及调控寄主防御反应的机理，揭示温度对病原菌和寄主的双重作用，为该病害的绿色防控和温度调控研究提供理论依据。【方法】以棉花抗病品种中植棉2号(ZZM2)、感病品种冀棉11(JM11)为试验材料，采用室内实验与病圃实验相结合，设置恒定温度(22、25、28和32℃)、自然变温两个处理，检测温度对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)生长、侵染定殖、棉花黄萎病发生的影响；通过调查活性氧(ROS)爆发、过氧化氢(H₂O₂)含量、胼胝质积累、防御相关基因表达水平等植物防御相关指标，解析温度调控棉花寄主防御反应的机制。【结果】在培养基上，25℃是大丽轮枝菌菌丝生长最适温度，22—28℃范围内适宜产孢；与培养基相比，不同棉花品种的叶片提取液对大丽轮枝菌生长均有促进作用，感病品种JM11促进作用更强；当温度为25—28℃时，ZZM2和JM11植株黄萎病发生均较重，低温22℃、高温32℃均不利于黄萎病发生。同时，在25℃处理下，棉花中大丽轮枝菌侵染定殖能力强，感病品种JM11比抗病品种ZZM2更易受到...     

马铃薯健株与黄萎病株根际土壤真菌群落结构及其对碳源利用特征

【目的】通过研究马铃薯健康植株与黄萎病株的根际土壤真菌群落结构与功能多样性的差异,明确土壤真菌群落结构与黄萎病发生之间的关系,为最终从微生物生态学的角度解释马铃薯黄萎病的发生原因及其生态防控提供理论依据。【方法】以河北省坝上地区马铃薯健株与黄萎病株的根际土壤为研究对象,分别利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和高通量测序(Illumina MiSeq)技术检测根际土壤中大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)ITS基因拷贝数量并分析真菌群落结构变化,结合冗余分析(RDA)明确真菌群落结构与土壤养分的相关性。同时利用Biolog-ECO平板法比较健株与黄萎病株根际土壤微生物对碳源的利用能力。【结果】马铃薯黄萎病的发生与土壤中大丽轮枝菌ITS基因拷贝数量存在相关性,在病株根际土壤中病原菌数量高,而在健株根际土壤中未检测到病原菌。高通量测序分析表明,病株根际土壤真菌多样性指数低于健康植株,但多样性差异不显著。在群落组成的门水平上,与健株根际土壤相比,病株根际土壤中的子囊菌门(Ascomycota)和丝孢菌门(Mortierellomycota)相对丰度上升幅度分...     

新疆棉田根际土壤真菌荧光PCR技术定量及其时空动态分析

【目的】研究新疆棉花黄萎病病株根际土壤真菌数量的时空动态变化,及棉花根际土壤真菌与黄萎病病原菌数量的相关性。【方法】用荧光定量PCR方法,测定新疆不同植棉区及其不同生育时期棉田根际土壤真菌总量和棉花黄萎病病原菌数量进行测定,分析棉花黄萎病病株根际土壤真菌数量在不同植棉区和不同生育时期的变化趋势,及棉花根际土壤真菌与棉花黄萎病病原菌数量的相关性。【结果】新疆不同植棉区的棉花在不同生育期其病株根际土壤真菌数量表现出不同变化趋势。哈密棉花病株吐絮期根际土壤真菌最大值达 6.16×10⁴ copies/g FRW;库尔勒棉花病株根际土壤真菌在苗期达到最大为4.23×10⁴ copies/g FRW;阿拉尔棉花病株根际土壤真菌在苗期至蕾期逐渐增加,随后逐渐减小,在吐絮期达到最小值为1.41×10^-4copies/g FRW。北疆精河和东疆哈密棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量的PCC分别高达0.989和0.993,呈显著正相关。南疆图木舒克棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量的PCC为0.880,呈正相关。【结论】新疆棉花黄萎病病株根际土壤真菌含量较高,在不同采样区和不同生育期,其根际土壤真菌总量均呈波动性变化。从棉花的四个生育期(苗期、蕾期、花铃期、吐絮期)来看,棉花病株根际土壤真菌数量最大值出现在吐絮期。新疆棉花病株根际土壤真菌数量的空间变化是东疆大于南疆大于北疆。在不同生态区,棉花根际土壤真菌和棉花黄萎病病原菌之间表现为正相关,而在不同发育期则表现为负相关。     

西瓜枯萎病抗性及其嫁接对根际土壤微生物数量及群落结构的影响

 【目的】揭示不同枯萎病抗性西瓜品种根际土壤微生物的差异及嫁接提高抗病性的土壤微生物学基础。【方法】以抗枯萎病西瓜品种‘甜妞’和感枯萎病西瓜品种‘天使’为试材,以南瓜（博强1号）为嫁接砧木,采用平板计数及PCR-DGGE技术,研究抗感枯萎病西瓜品种自根苗、嫁接苗和砧木不同生育期根际土壤微生物数量及群落结构的变化。【结果】抗性品种根际土壤细菌数量在生育期的中后期显著高于感病品种,根际土壤真菌数量显著低于感病品种;感病品种嫁接后根际土壤细菌和放线菌数量均高于非嫁接处理,而镰孢菌除苗期外均低于非嫁接处理;PCR-DGGE结果表明,不同处理根际土壤细菌、真菌群落结构存在差异,且随生育期的变化而变化。对差异条带测序分析说明不同西瓜品种及嫁接砧木南瓜根际分布不同的细菌和真菌群。【结论】西瓜抗病品种的根际土壤细菌和放线菌的数量显著高于感病品种,而真菌和镰孢菌数量显著低于感病品种,品种的抗性与根际土壤微生物的种群和数量密切相关;嫁接提高了感病品种根际土壤细菌、放线菌微生物数量,抑制了枯萎病菌的积聚,改变了根际土壤微生物群落结构。植物基因型对根际土壤微生物群落结构有显著影响,而根际微生物群落结构的不同将导致植物对病原菌的抗性差异及品种差异。     

棉花黄萎病菌毒素对棉花生化代谢的影响

为明确棉花黄萎病菌毒素对棉花生化代谢的影响,采用棉花黄萎病菌毒素处理棉花黄萎病抗病和感病品种的棉苗后,测定棉株体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性以及丙二醛(MDA)和木质素含量的动态变化。结果表明,抗病品种陕7191对病菌毒素的抗性显著高于感病品种中棉19;接种毒素后2品种棉苗叶片SOD活性都降低,感病品种降幅高于抗病品种;感病品种POD活性升高较快,到达峰值后迅速下降,而抗病品种POD活性持续上升;2品种PAL活性变化趋势相似,接种后抗病品种活性始终高于感病品种;2品种MDA和木质素含量均增多,感病品种MDA含量的增幅和增量高于抗病品种。     

生防菌在棉田土壤中定殖数量与防病作用相关性

【目的】研究拮抗菌施入棉田土壤后生防菌的数量变化和棉花黄萎病的发病情况,分析生防菌的定殖与防病的相互关系,为生防细菌在棉花黄萎病的防治应用提供理论依据。【方法】选择4株棉花内生和根际拮抗菌Bacillus atrophaeus SHZ-24、Bacillus vanillea SMT-24、Bacillu subtilis SHT-15和Bacillus velezensis BHZ-29进行盆栽试验,使用平板计数和实时荧光定量分析细菌和病原菌。【结果】4株拮抗细菌在土壤中数量变化趋势相同,50 d时的存活量从高到低分别为SHZ-24、BHZ-29、SMT-24、SHT-15,4株拮抗细菌处理均可降低棉苗的病情指数。【结论】BHZ-29的防病效果较好。4株拮抗细菌在土壤中的定殖数量与防病效果呈显著正相关。     

不同黄萎病抗性棉花品种对土壤微生物数量的影响

[目的]阐明棉花不同抗性品种与土壤微生物群落的关系,为棉花抗黄萎病机理和防治措施提供理论依据.[方法]选取5种不同抗性棉花品种在根盒中进行培养,对根际和距根际不同距离土壤中真菌、放线菌和细菌进行平板计数.[结果]健康土壤培养抗病棉花品种根系对土壤中细菌和放线菌有聚集作用,对真菌有一定的排斥作用;耐病和感病品种则相反.接入拮抗菌和施微生物有机肥能够增加细菌和放线菌数量,降低真菌的比例.[结论]土壤微生物数量及比例与棉花抗性存在密切相关性.     

棉花内生蜡状芽孢杆菌YUPP-10对棉花黄萎病的防治作用及机制

【目的】棉花黄萎病(Verticillium wilt)是世界性难以防治的病害,筛选有效的生防微生物资源成为解决棉花黄萎病的重要途径之一,本研究旨在分离一株高效拮抗细菌,并明确其防治机理,为生物防治棉花黄萎病提供技术支持。【方法】用葡甘聚糖作为碳源筛选一株能够降解β-1,4糖苷键的棉花内生细菌YUPP-10,通过平板对峙培养、平板对扣培养和悬滴法等测定YUPP-10对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)菌丝生长和孢子萌发的抑制效果;用YUPP-10无菌滤液培养大丽轮枝菌微菌核,检测其对微菌核萌发的影响;利用基质接种法进行盆栽试验探究其对棉花黄萎病的防治效果;通过胚根、叶片接种病原菌,木质化和活性氧爆发研究YUPP-10诱导抗病能力;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测防御相关基因的表达。【结果】成功获取一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)YUPP-10,其整体代谢产物在7 d时对大丽轮枝菌的抑菌带宽为0.73 cm,挥发性代谢产物在10 d时对大丽轮枝菌菌落的抑制率为77.03%;YUPP-10无菌培养液对大丽轮枝菌孢子和菌核萌发的抑制率分别为17.22%—71.25%和10.69%—26.62%,且抑制率与无菌滤液的浓度呈正相关。在用YUPP-10玉米蛭石培养物拌土处理的盆栽试验中,其对棉花黄萎病的最高防效达到80.60%。诱导抗性试验发现YUPP-10诱导了胚根和叶片抗大丽轮枝菌的侵染,诱导了细胞木质化和活性氧的爆发。qRT-PCR检测结果显示YUPP-10成功激活了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、几丁质酶(CHI)和病程相关基因(PR10)的表达,对大丽轮枝菌在棉花体内的扩散和生长起到了抑制作用。【结论】YUPP-10通过直接抑制病原菌的生长,同时诱导植物防御反应来抵抗病原菌的侵染和扩展,其具有良好的应用前景。     

Control Efficacy of Broccoli Residues on Cotton Verticillium Wilt and Its Effect on Soil Bacterial Community at Different Growth Stages

【Objective】The objective of this study is to research the effects of broccoli residues (BR) on cotton verticillium wilt and soil bacterial community structure at different growth stages, and to provide new ways and ideas for green ecological control of cotton verticillium wilt and reduction of chemical pesticides.【Method】In the field plot experiment, the soil planted with cotton was treated with broccoli residues and no broccoli residues (CK). The incidence dynamics of cotton verticillium wilt in different treatments were monitored at different growth stages. The number of DNA copies of Verticillium dahliae was determined by real-time quantitative PCR, and the structure of soil bacterial communities was measured by high-throughput sequencing (Illumina MiSeq). The effects of broccoli residues returning to soil on the quantity of pathogen and the community of soil bacteria were analyzed. Principal component analysis (PCA) was used to explore the characteristics and rules of structural changes of soil bacterial community at the level of phylum and genus in different growth stages.【Result】The incidence and disease index of cotton verticillium wilt showed a downward trend after the return of broccoli residues to soil, respectively. Moreover, the peak period of verticillium wilt was delayed, and 70.77% control efficacy was achieved at the peak period. The development curve of disease index and time course of disease in the whole growth period was established, and the average control efficacy was 57.21%. Compared to the blank control, the number of DNA copies of V. dahliae was decreased by 10.96%, 11.11%, 25.95% and 11.25% at the 4 stages of cotton growing and non-growing season, respectively, after the return of broccoli residues to soil. Illumina MiSeq analysis showed that broccoli residues treatment significantly increased soil bacterial diversity. The richness index Chao1 was increased significantly at all growth stages, and the ACE index was significantly increased at the pre-sowing stage, flowering and boll stage and boll-opening stage. Compared to the blank control, the relative abundance of Actinobacteria was increased significantly at different growth stages after the return of broccoli residues to soil. Meanwhile, the results showed that there were differences in the composition of dominant microorganisms at different growth stages after the return of broccoli residues to soil. For example, Firmicutes increased to the dominant microflora at the pre-sowing stage and seedling stage, and Cyanobacteria became the dominant microflora at the bud stage and flowering and boll stage. Principal component analysis showed that broccoli residues to soil changed the structure of bacterial community at seedling stage, bud stage, flowering and boll stage and boll-opening stage. Further analysis showed that the relative abundance of Streptomyces and Bacillus was significantly increased after the return of broccoli residues to soil.【Conclusion】Broccoli residues returning to soil can effectively inhibit the occurrence of cotton verticillium wilt, reduce the number of DNA copies of V. dahliae in soil, change the structure of soil bacterial community, and increase the relative abundance of beneficial microorganisms, which is an effective green measure to control cotton verticillium wilt.     

大丽轮枝菌木糖苷酶基因的鉴定及基于HIGS技术的功能分析

【目的】 从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）中鉴定木糖苷酶基因,研究其与大丽轮枝菌致病力的关系,为解析大丽轮枝菌致病分子机制提供理论依据,同时为制定更好的棉花黄萎病防治策略提供科学依据。【方法】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌基因组数据库中鉴定全部木糖苷酶基因,并对基因编码蛋白的结构域、基因的染色体定位及进化关系等进行分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品种根系分泌物培养0、6、12、24和48 h大丽轮枝菌中的表达量。利用寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术对木糖苷酶基因VdxyL3在大丽轮枝菌侵染过程中的功能进行初步分析。将VdxyL3的目标片段转化棉花,采用伤根法接种大丽轮枝菌Vd991,观察转化植株的表型,调查病情指数,同时利用qRT-PCR技术对植株中真菌生物量和VdxyL3的表达量进行检测。【结果】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌中查找出13个木糖苷酶基因（VdxyL1—VdxyL13）,其编码序列长度介于1 461—2 544 bp,蛋白质分子量介于38.78—90.97 kD,理论等电点介于4.67—5.89。结构域和进化树分析发现13个木糖苷酶基因中包括9个糖苷水解酶43家族成员、1个3家族成员和3个31家族成员。染色体定位分析发现13个基因分布在6条染色体上,未形成基因簇。qRT-PCR结果发现选取的6个基因均受到根系分泌物的诱导,在一种或多种根系分泌物中培养6 h或12 h后,表达量均明显升高,然后降低。其中VdxyL3受海岛棉根系分泌物诱导后表达量明显升高,表明该基因的表达明显受海岛棉根系分泌物的诱导。HIGS研究结果表明,接菌14 d和21 d后转化VdxyL3基因干扰片段的棉花发病明显较重,其病情指数（33.3和83.9）明显高于空载体对照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析发现转化VdxyL3基因干扰片段的棉花植株茎中VdxyL3的表达量明显低于空载体对照,真菌生物量显著多于对照。【结论】 利用HIGS技术将VdxyL3基因沉默后,棉株的抗病性明显降低,表明VdxyL3在大丽轮枝菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。     

拮抗细菌KRS022的鉴定及对大丽轮枝菌的抑制效果

【目的】明确拮抗细菌KRS022的分类地位及对多种病原真菌的抑制作用,重点研究对作物黄萎病的防治效果及其对病原大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）的抑制效果,为抗大丽轮枝菌生防制剂的研发提供资源。【方法】通过形态学、生理生化试验及16S rDNA与gyrB基因序列串联分析确定KRS022的分类地位;采用对峙培养法和对扣熏蒸法测试KRS022对多种真菌的抑制作用;采用发酵菌液平板法、涂布法以及对扣熏蒸法明确KRS022对大丽轮枝菌的平板抑制效果;通过无细胞上清共培养法与对扣熏蒸法明确KRS022对大丽轮枝菌孢子萌发及菌丝形态的影响;通过盆栽试验及大丽轮枝菌生物量测定明确KRS022对棉花和烟草黄萎病的防治效果;利用RT-qPCR法检测KRS022激发植物免疫相关基因的表达特性。【结果】拮抗菌株KRS022为革兰氏阴性细菌,鉴定为产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）。该菌株具有解磷、解钾、固氮功能,可产生嗜铁素,具有蛋白酶、淀粉酶、过氧化氢酶活性,属于好氧产碱型细菌,100μg·mL-1氨苄青霉素可作为该菌株的天然抗性筛选条件。KRS022对多种...     

棉花CRVW的克隆与抗黄萎病功能分析

目的 黄萎病（Verticillium wilt）是棉花生产上的重要病害,严重影响棉花的产量和品质。棉花基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。通过对一个尚未有功能注释的陆地棉基因CRVW（cotton resistance to Verticillium wilt）进行克隆与抗病功能验证,为棉花基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面奠定基础。方法 根据参考基因组序列设计引物,同源克隆陆地棉（Gossypium hirsutum）农大601（ND601）中CRVW的开放读码框（open reading frame,ORF）。利用在线工具ProtParam预测蛋白氨基酸组成、分子量、理论等电点、不稳定指数和总平均亲水性等性质;应用PSIPRED v3.3预测蛋白二级结构;在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测;PlantCARE在线软件分析顺式作用元件。构建CRVW与绿色荧光蛋白基因融合表达载体,通过基因枪介导法转化洋葱表皮细胞,观察CRVW的表达位置。利用qRT-PCR检测CRVW在棉花不同组织、黄萎病菌胁迫条件下不同抗、感品种间,以及水杨酸（salicylic acid,SA）诱导处理条件下的表达模式。构建CRVW沉默载体,应用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术进一步验证该基因在棉花中的抗病功能。检测CRVW沉默后一些与植物抗病调控相关标志基因的表达变化,分析其介导的抗病通路。结果 从陆地棉品种ND601中克隆到CRVW的ORF,其全长780 bp,编码259个氨基酸残基,分子量约为30.2 kD,理论等电点9.59;蛋白二级结构含69.50%不规则卷曲、17.76% α-螺旋、11.20%延伸链和1.54% β-卷曲。综合生物信息学预测和荧光观察结果,显示CRVW主要存在于植物细胞膜和细胞质。CRVW在棉花根、茎和叶中都有表达,但在根中的表达量最高。CRVW的ORF上游序列（CRVW-P）中包括响应乙烯（ethylene）、SA、生长素（auxin）和脱落酸（abscisic acid）等4种激素信号的顺式作用元件。另外,CRVW-P还包括一些与伤害、防御、胁迫、病菌、干旱和低温等相关的顺式作用元件。SA喷洒处理后,CRVW显著上调表达。黄萎病菌胁迫后,CRVW在抗病品种ND601和感病品种中棉所8号（CCRI8）中均显著上调表达,但在感病品种中上调表达的发生时间明显滞后。黄萎病菌处理20 d后,CRVW沉默组棉苗表现出比对照（CK）组更明显的黄化、萎蔫和落叶等黄萎病病症。进一步统计分析显示,CRVW沉默组病指显著高于CK组,表明CRVW沉默显著降低了棉苗对黄萎病菌的抗性。沉默CRVW后,棉苗中SA含量显著降低;ICS1（isochorismate synthase 1）、EDS1（enhanced disease susceptibility 1）、PAD4（phytoalexin deficient 4）、NPR1（nonexpresser of PR gene 1）和PR1（pathogenesis-related protein 1）等与SA积累和信号调控相关的标志基因均发生显著下调表达。结论 CRVW定位于细胞质和细胞膜,主要在棉花根部表达,可能通过SA信号通道参与棉花抗黄萎病反应过程。     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌Verticillium dahliae）中一个新基因（VdHP1）的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因（VdCrz1、VdNoxB、VdPls1）、分泌蛋白释放相关基因（VdSep5）及分生孢子产生相关基因（Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2）在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因（VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1）在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

不同碳氮比对棉花黄萎病菌主要生物学性状及致病力的影响

【目的】 研究不同碳氮比(C/N)营养条件对棉花大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)主要生物学性状及致病力的影响。为调整碳氮比例减少大丽轮枝菌的为害提供理论依据。【方法】 将不同致病类型的2个大丽轮枝菌菌株在不同碳氮比的培养基上进行培养,测定大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢量、菌丝量、孢子萌发率及致病力。【结果】 不同碳氮比营养条件明显影响大丽轮枝菌落叶型菌株微菌核的形成,在低碳氮比(25∶1～30∶1)中形成的微菌核明显多于在高碳氮比(45∶1～50∶1)中形成的微菌核。25∶1的碳氮比最有利于大丽轮枝菌产孢和菌丝生长,碳氮比高于35∶1大丽轮枝菌产孢量和菌丝生长量明显减少。40∶1的碳氮比最有利于大丽轮枝菌的孢子萌发。在感病品种上,25∶1的碳氮比最有利于大丽轮枝菌致病,碳氮比高于35∶1大丽轮枝菌致病力明显减弱;只有35∶1的碳氮比才有利于大丽轮枝菌致病,过高或过低的碳氮比都不利于大丽轮枝菌致病。【结论】 不同碳氮比营养条件对两种不同致病类型大丽轮枝菌的生长、繁殖及致病力都有影响,低碳氮比(25∶1)有利于大丽轮枝菌的菌核形成、分生孢子产生和菌丝生长,在感病品种上表现出较强致病性;高碳氮比(高于40∶1)不利于大丽轮枝菌生长、繁殖和致病。     

香蕉套种黑皮冬瓜对香蕉枯萎病的防控效果及土壤微生物群落的影响

【目的】探索香蕉套种黑皮冬瓜后对香蕉枯萎病的防控效果及蕉园土壤微生物群落的影响,为香蕉枯萎病的综合防控提供理论参考。【方法】以抗（耐）枯萎病香蕉品种桂蕉9号、易感枯萎病香蕉品种桂蕉1号为试验材料,在上一造香蕉枯萎病发病率大于50%的蕉园进行随机区组试验,设桂蕉9号套种黑皮冬瓜、桂蕉9号单作、桂蕉1号套种黑皮冬瓜和桂蕉1号单作4个处理,调查香蕉枯萎病发病率、香蕉和冬瓜采收后产量,检测冬瓜采收后蕉园土壤的理化性质和微生物数量,并通过高通量测序技术研究不同处理间土壤细菌群落结构和组成的差异。【结果】桂蕉9号套种黑皮冬瓜、桂蕉9号单作、桂蕉1号套种黑皮冬瓜和桂蕉1号单作香蕉枯萎病发病率分别为1.48%、14.44%、52.96%和70.00%。香蕉套种黑皮冬瓜后虽平均单株产量与单作香蕉相比差异不显著（P>0.05）,但折合每公顷香蕉产量因枯萎病发病率的降低而有所增加。桂蕉9号和桂蕉1号套种黑皮冬瓜后土壤pH分别较单作该香蕉品种显著提高24.00%和19.45%（P<0.05,下同）、土壤电导率（EC）显著下降78.48%和72.55%、土壤碱解氮含量显著升高72.92%和72.73%、土壤细菌及放线菌数量显著增加,Chaol指数和Shannon指数显著提高,Simpson指数显著降低。套种黑皮冬瓜提高了土壤细菌变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度,降低了绿弯菌门（Chloroflexi）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度。套种黑皮冬瓜改变了土壤细菌群落结构,增加了土壤细菌的多样性及丰富度。抗（耐）枯萎病香蕉品种套种黑皮冬瓜的防病效果比感病品种更明显。【结论】抗（耐）枯萎病香蕉品种套种黑皮冬瓜可通过提高土壤pH、降低土壤电导率、提高土壤碱解氮含量、改变土壤细菌群落结构达到降低香蕉枯萎病发病率的目的。抗（耐）枯萎病香蕉品种套种黑皮冬瓜种植模式可在广西香蕉枯萎病病区推广应用。     

基于PCR检测棉花4种病原菌在新疆北部分布

【目的】明确新疆北部棉花主要病原菌及其分布,为新疆棉花数据库的建立提供数据,为棉花主要病害的高效防控提供依据。【方法】针对棉花主要根茎部病害从新疆北部9个市县级(含附近团场)采样区域中广泛采集病株,利用4种病害(枯萎病、立枯病、黄萎病和红腐病)各自的病原菌的特异性引物进行PCR检测。【结果】从9个采样区域,共72份以村(连)为单位的混合病样中,普遍或较普遍地检测到4种病害的病原菌,但各病原菌检出率有较大差异。其中,尖孢镰刀菌的检出率较高,为84.72%;立枯丝核菌次之,为56.94%;大丽轮枝菌和串珠镰刀菌检出率相对较低,分别为45.83%和37.50%。【结论】在所有采样区域中尖孢镰刀菌及所引起的枯萎病分布最为普遍,立枯丝核菌及所引起的立枯病次之,2种病原菌及所致病害在各采样区域的大多数村(连)都有分布;大丽轮枝菌及所引起的黄萎病在各采样区域以及近半数的村(连)有分布,串珠镰刀菌及所引起的红腐病分布不广,有明显的区域性,仅个别采样区域有较高频的分布。     

基于不同土壤质地棉花根际微生物和酶活性特征分析

为了明确不同质地土壤对花铃期棉花根际微生物数量与酶活性的影响,采用池栽方式,以‘鲁研棉21’为材料,研究不同质地土壤(砂土、壤土、粘土)种植棉花在花铃期根际细菌、真菌、放线菌的数量及磷酸酶、脲酶和蔗糖酶的活性特征。结果表明,随着花铃期棉花的生长发育,3种质地土壤的根际微生物数量和酶活性均呈低-高-低动态变化的单峰曲线,其峰值分别出现在发育最盛的盛花期和盛花期后11 d。在土壤微生物数量方面,砂土整个花铃期3种微生物数量均显著或极显著低于壤土和粘土;而壤土中的微生物数量仅在初花后11 d低于粘土,其他时段均高于粘土。酶活性方面,砂土整个花铃期3种酶活性均显著或极显著低于壤土和粘土;壤土在初花至花后22 d时高于粘土,其余时段低于粘土,但差异均不显著。综上,棉花花铃期根际微生物活性受生长发育进程和土壤质地的双重影响。研究为棉花生产合理布局提供依据。