靶向测序基因型检测（GBTS）技术及其应用

借助于分子标记进行基因型检测的技术在生物遗传改良等领域发挥着重要的作用。国际跨国种业公司凭借其高通量、自动化、大规模的共享检测平台,基因型检测技术得到广泛应用。随着从3G时代的高成本固相芯片和随机测序式基因型检测(genotyping by sequencing,GBS)发展到成本低、对检测平台要求较低、基于靶向测序基因型检测(genotyping by target sequencing,GBTS)的液相芯片,基因型检测技术完成了向4G时代的转变。在本文中首先介绍了两项最新的GBTS技术(基于多重PCR的GenoPlexs和基于液相探针捕获的GenoBaits)及其原理。同时,发展了可以在单个扩增子内检测多个SNP,称之为多聚单核苷酸多态性(multiple single-nucleotide-polymorphism cluster,mSNP或multiple dispersed nucleotide polymorphism,MNP)的技术,极大地提高了目标位点(扩增子)内变异的检测效率。与GBS和固相芯片相比,GBTS技术具有平台广适性、标记灵活性、检测高效性、信息可加性、支撑便捷性和应用广谱性。同一款标记集(例如玉米40K mSNP),可以获得3种不同的标记形式(40K mSNP、260K SNP和754K单倍型);并可以根据应用场景的需求,通过控制测序深度获得多种不同的标记密度(1—40K mSNP)。GenoPlexs和GenoBaits 2种技术相结合,可广泛应用于生物进化、遗传图谱构建、基因定位克隆、标记性状关联检测(全基因组关联分析——GWAS和混合样本分析——BSA)、后裔鉴定、基因渐渗、基因累加、品种权保护、品种质量监测、转基因成分/基因编辑/伴生生物检测等领域。目前,已经在20余种主要农作物、蔬菜以及部分动物和微生物中开发了GBTS标记50余套,并已广泛应用于上述领域。最后,展望了与未来GBTS应用相关的几个问题,包括便携式、自动化、高通量、智能化检测平台;根据用户需求定制的可变密度、多功能分子检测;GBTS与其他技术(KASP、高密度芯片、BSA策略等)的整合;基于资源共享的开源育种等。这些将推动GBTS技术在动物、植物和微生物遗传改良等领域的广泛应用。     

基于GBS测序开发SNP在植物上的应用进展

基因分型测序(genotyping by sequencing,GBS)因具有实现相对简单、成本较低、可产生高通量SNP的优点而受到青睐。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)因简单、快速、特异性强、稳定遗传、便于检测等特点已成为目前最广泛使用的分子标记之一。本文就利用GBS技术开发SNP分子标记近年来在亲缘关系评价、重要农艺性状鉴定、遗传多样性研究、遗传图谱构建以及基因定位等方面在国内外的研究进展进行综述,并对其今后的研究提出展望,以期为其在植物上的更广泛应用提供参考。     

GBS技术在植物中的研究进展

随着高通量测序技术的发展,一种高效而经济的SNP(single nucleotide polymorphism)发掘和基因分型技术GBS(genotyping by sequencing)被开发出来,避免了传统基因型鉴别方法的不足,现已被广泛应用于植物遗传图谱构建、全基因组关联分析、基因多样性研究以及种质鉴定和品种识别等多个领域。从GBS技术的原理、流程、特点以及应用等方面对近年来植物应用GBS技术所进行的研究进展进行综述,并提出了今后GBS技术的研究重点,以期为GBS技术在植物的应用研究提供参考。     

分子植物育种助推南繁种业转型升级

异地加代可以经济有效地加快育种进程。长期以来,海南省作为中国最南端省份,只在冬季用来进行育种材料的扩繁和加代,其周年可以种植农作物的自然气候和环境并未得到充分有效地利用。分子标记辅助育种与其他现代育种技术相融合,将助推南繁种业从单一的繁殖加代向资源引进和评价、育种选择、纯度检测、种质交流和产权保护等在内的全产业链模式转变,实现从海南冬繁到周年育种的转变,将海南的南繁地理和生态优势转化为南繁与育种相整合的全产业链优势,加快育种进展、提高育种效率,促进种业发展。本文讨论了海南地理生态优势与南繁种业现状,南繁种业转型升级的必要性和可能性,以及所面临的挑战和机遇。实现南繁种业的转型升级有赖于异地选择观念的转变、国家相关政策的支持、分子育种平台的支撑、生物安全防控、品种保护制度的建立和完善、资源共享和交流机制的形成。数量和群体遗传、基因型和环境互作、分子设计和大数据构成了南繁种业转型升级所需的育种理论。分子设计包括宏观水平的个体设计、群体设计和物种设计,微观水平的基因设计、代谢设计和网络设计。高通量精准表现型鉴定、环境型鉴定、信息处理和网络技术、决策支撑系统等是南繁种业转型升级所需的育种平台。作为分子育种的核心支撑,现已发展了基于靶向测序-液相芯片的基因型检测（genotyping by target sequencing and liquid chip,GBTS-LC）技术,通过GenoPlexs可以实现高达5 000对标记引物高度均一的多重PCR靶向扩增,而基于液态探针捕获的GenoBaits,可以获取高达40K个目标位点（每个位点包含多个SNP）。该技术具有平台广适性、标记灵活性、检测高效性、信息可加性、支撑便捷性、应用广普性,已成为分子育种中取代固相芯片的重要分子检测技术。要实现“海南育种,全国测试”,需要构建包括高效育种设施、快速育种、转基因和基因编辑技术、双单倍体育种技术、全基因组选择等在内的综合育种体系。为此,要倡导资源共享的开源育种模式,建设横跨动植物的共性方法、技术和平台,开展资源引进、监测和评价,构建种质资源指纹图谱,强化品种权保护、种子质量控制和纯度检测。希望借此推进有关南繁种业转型升级的公众讨论和政府决策,从而推进整个种业的科技进步和现代化。     

SNPs检测方法研究进展

分子标记在生物的遗传多样性分析、基因标记、连锁图谱的构建、基因组结构与功能研究、遗传改良和医学研究等领域有重要的应用价值。SNP作为一类新型分子标记,在上述诸多领域特别是关联分析和单体型构图中有特殊的应用价值,近几年研究取得了长足进展。但SNP标记又不象以往的RFLP或基于PCR的标记,后者都有基本统一的检测方法,SNP的检测方法多种多样,而且每年都有许多新的检测技术问世。对SNP检测方法进行系统了解,对SNP研究有着重要意义。SNP检测方法可以划分为杂交法、熔解法、电泳法、测序法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法。作者对SNP检测方法进行了较详细的回顾和分析。     

3款猪50K SNP芯片基因型填充至序列数据的效果评估

【目的】利用猪 50K SNP（Single nucleotide polymorphisms） 芯片开展基因组育种已经得到了广泛的应用与认可。基因型填充可在不增加基因型检测成本的前提下大幅提高基因型数据量，有利于开展复杂性状的遗传解析与遗传评估。本研究旨在评估 3 款猪 SNP 芯片基因型填充至序列数据的填充效果。【方法】选用 3 款芯片共同检测的 48 头杜洛克猪群体作为填充的目标群体，260 头猪的全基因组测序数据作为参考群体，使用Beagle5.1 软件进行基因型填充，对比 3 款不同猪 SNP 芯片纽勤 50K、中芯一号 50K 和液相 50K 基因型填充至序列数据的填充效果。【结果】 3 款芯片原始的 SNP 数分别为 50 697、57 466 和 50 885 个。填充至序列后，未质控时位点填充准确性 （基因型一致性） 分别为 0.886、0.886 和 0.898，质控过滤 DR²（Dosage R-squared）<0.95 的位点后，填充准确性 （基因型一致性） 分别提升至 0.974、0.976 和 0.969，位点数分别为 3 39...     

单核苷酸多态性在大豆育种中的应用

单核苷酸多态性 (singlenucleotidepolymorphism ,SNP)是指DNA序列上的单个碱基变异 ,它具有分布广、多态信息量大、易于检测和统计分析等优点 ,被称为继RFLP和微卫星标记后的第三代基因遗传标记。单核苷酸多态性是等位基因间序列差异最为普遍的类型 ,可作为一种高通量的遗传标记。已建立PCR扩增目标序列及其产物测序和电子SNP(eSNP)等多种发现和检测SNP的方法。大豆等作物也已开展了SNP分析。     

迪庆藏猪ADFP基因多态性及其组织表达特征

【目的】从分子遗传学角度分析不同基因型迪庆藏猪群体不同组织中ADFP基因的表达差异,为迪庆藏猪的选育工作提供参考依据。【方法】利用PCR扩增测序方法对113头迪庆藏猪ADFP基因进行扩增测序,利用DNA-STAR 5.0对序列进行比对分析及多态性位点（SNPs）检测;同时利用实时荧光定量PCR方法对迪庆藏猪不同组织中ADFP基因相对表达量进行检测,并运用SPSS 20.0分析ADFP基因多态性对迪庆藏猪群体不同组织中ADFP基因表达水平的影响。【结果】在迪庆藏猪ADFP基因外显子6上发现3个SNPs,分别为SNP1（C→T）、SNP2（C→T）和SNP3（T→ C）,其中SNP1和SNP2位点属于低度多态（PIC/He<0.25）,SNP3位点属于中度多态（0.25He<0.5）。迪庆藏猪不同组织中ADFP基因相对表达量存在显著差异（P<0.05,下同）,皮下脂肪中相对表达量最高,其次为肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、腿肌和背肌,心脏中相对表达量最少;另外,ADFP基因SNPs不同基因型迪庆藏猪群体中各组织的相对表达量也存在显著差异,尤其在SNP2位点杂合基因型群体肾脏中相对表达量显著高于纯合基因型群体肾脏中相对表达量,表明ADFP基因SNPs变异对迪庆藏猪组织中ADFP基因表达具有影响。【结论】ADFP基因SNPs变异对迪庆藏猪组织中ADFP基因会产生差异表达,进而影响机体脂肪沉积,ADFP基因可作为迪庆藏猪肌内脂肪沉积的候选基因。     

萝卜花叶性状的遗传分析及基因定位

为筛选控制萝卜花叶性状的候选基因,以萝卜花叶品种J4和板叶品种WA构建F₂分离群体,在F₂群体中,选择20个花叶和20个板叶单株,分别构成花叶和板叶DNA混合池,分析花叶性状的遗传规律。结果显示:萝卜花叶性状受1对基因控制,且花叶对板叶呈不完全显性;结合集团分离分析（bulked segregant analysis,BSA）与简化基因组测序基因型分析技术（genotyping by sequencing,GBS）,将花叶基因定位在R7染色体0.07～7.97 Mb区间内;通过萝卜全基因组与甘蓝型油菜全基因组的共线性分析发现,萝卜候选区间内0.87～1.32 Mb与油菜A10染色体的16.35～16.80 Mb存在很好的共线性;对共线性区段进行基因功能注释确认Rs390250（899863～901 651 bp）为萝卜花叶的候选基因;该基因编码1个HD-ZipⅠ（the class Ⅰ homeodomain leucine-zipper）转录因子,其位于第二外显子的非同义突变位点T425C会导致LZ（leucine zipper）结构域内保...     

基于HRM技术的草鱼抗小瓜虫nlrc3基因SNP标记开发及关联分析

为探究草鱼nlrc3基因的多态性和抗多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）病之间的关联性,通过多子小瓜虫感染草鱼（Ctenopharyngodon idella）筛选出易感群体和抗病群体,并分析比较两个群体nlrc3基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）位点,使用高分辨率熔解（High resolution melt, HRM）和Sanger测序技术验证SNP位点基因型,并将获得的SNP位点与草鱼抗病性状进行关联性分析。结果显示,从草鱼nlrc3基因中筛选得到了4个SNPs位点,有3个SNPs位点（SNP1、SNP3和SNP4）成功分型,其中SNP1和SNP3中分别含有AA、AG和AA、GG两种基因型,且与抗多子小瓜虫性状显著相关;倍型组合及其与抗病能力相关性分析显示,与其他二倍型相比,由SNP1的AG和SNP3的AA基因型组成的二倍型（D1）中100%为抗病个体,由SNP1的AG与SNP3的GG基因型组成的二倍型（D2）中95%为抗病个体,均为抗病优势基因型。研究表明,抗小瓜虫的草鱼全体中存在nl...     

SNPS在大豆等作物遗传及改良中的应用

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指DNA序列上的单个碱基变异,它具有分布广、多态信息量大、易于检测和统计分析等优点,被称为继RFLP和微卫星标记后的第三代基因遗传标记。单核苷酸多态性是等位基因间序列差异最为普遍的类型,可作为一种高通量的遗传标记。已建立PCR扩增目标序列及其产物测序和电子SNP(eSNP)等多种发现和检测SNP的方法。大豆等作物也已开展了SNP分析。一些栽培作物种质的多样件不断减少,其结果连锁不平衡(linkagedise鄄quilibrium,LD)增加,这有利于目的基因座上SNP单元型(haplotype)与表型的相关性分析。SNP已在作物基因作图及其整合、分子标记辅助育种和功能基因组学等领域展示了广泛的应用价值。     

采用GBS-seq技术构建甜瓜高密度遗传图谱

【目的】构建甜瓜高密度遗传图谱,为研究甜瓜重要性状基因定位及功能分析奠定基础。【方法】以甜瓜材料K7-4(高抗霜霉病)和K7-2(高感霜霉病)为亲本,杂交再自交得到 F₂分离群体。构建GBS文库并进行双末端测序,使用滑动窗口的方法进行基因型分型,SAM TOOLS软件检测SNP位点,采用Joinmap 4.0软件进行排图,用perl SVG模块绘制连锁图,用win QTL cart 2.5进行QTL检验,根据复合区间作图法,使用R/qtl软件包进行QTL定位。【结果】构建了总长为4 823.55 cM的遗传图谱,标记间平均遗传距离为1.43 cM。在苗期、生长中期和生长后期共检测到26个与甜瓜霜霉病性状相关的QTL。【结论】基于GBS-seq技术获得了甜瓜高密度遗传图谱,最终将抗霜霉病基因关联到CM3.5.1_scaffold00005上的6,831,227~7,830,935 bp,约1Mb的区间范围内。     

利用连锁不平衡发掘作物种质资源中优异基因的研究进展

作物种质资源中保留着大量的优异基因.由于缺乏合适的统计方法,作物种质资源中蕴藏的丰富遗传变异还未能充分发掘和利用.连锁不平衡分析是对基因(或已定位的高分辨率QTL)的功能进行鉴定的有效方法.DNA测序技术和高通量SNP分析等技术的发展,使利用连锁不平衡法进行优异基因的发掘成为了可能.综述了有关利用连锁不平衡发掘作物种质资源中优异基因的研究进展.     

基于HRM获得与桃Tssd紧密连锁的SNP标记

【目的】植物中,SNP标记具有分布广泛、分辨率高、共显性和多态性高等特点,是遗传研究的常用分子标记。桃全基因组测序完成,获得了大量SNP位点。利用现有的SNP数据进行简单、快速的SNP基因分型是基因定位、品种鉴定和图谱构建等后续研究的基础。文章拟建立采用高分辨率熔解曲线进行不同类型SNP的基因分型方法,以获得与桃温度敏感半矮生型基因紧密连锁的分子标记。【方法】以普通生长型(ST)单株97-32-46为母本,温度敏感半矮生型单株03-94-2(Tssd)为父本进行人工杂交,利用其分离群体96个后代单株为研究材料。在定位目标基因的区间内开发连锁和不同类型的SNP标记的基础上,采用高分辨率熔解曲线进行SNP的基因分型并获得与目标性状紧密连锁的SNP标记。【结果】明确了DNA模板和Mg~(2+)是影响基因分型的关键因子,并确立了反应体系最佳浓度区间。在15μL反应体系中模板DNA的量低于5.0 ng时或Mg~(2+)浓度低于1.6μmol·L~(-1)时则不能完成PCR扩增和基因分型;根据亲本基因型和表型一致的SNP位点设计引物,扩增片段长度在140 bp左右。高分辨率熔解曲线分析可对由单个核苷酸变异引起的4种不同类型的SNP(A/T、A/G、A/C和C/G)进行基因分型,并正确区分了温度敏感半矮生型和普通生长型,与进行Sanger测序鉴定的结果一致。采用96孔板对温度敏感半矮生型和普通生长型各48个分离后代单株进行了PCR扩增和基因分型,确定了遗传距离。分型结果表明高分辨率熔解曲线分析技术可以将96个样杂交后代单株分为温度敏感半矮生型和普通生长型2种,正确地区分了A/A基因型和A/T基因型。在96个样品中仅1个没有成功扩增,在温度敏感半矮生型和普通生长型中各存在1个重组单株。获得与温度敏感半矮生型基因紧密连锁的SNP标记,遗传距离为2.11 cM。【结论】建立了基于高分辨率熔解曲线分析的SNP基因分型。尽管高分辨率熔解曲线分析技术无法区分两种不同纯合类型的SNP变异,但仍不失为区分已知变异SNP的有效方法。在已经获得桃大量SNP的基础上,该体系可用于桃的基因定位、遗传多样性和品种鉴定等研究。     

斑点鲶鱼的基因图谱及遗传标记选育研究

本文主要总结斑点鲶鱼基因组学研究的最新动态。斑点鲶鱼和蓝色鲶鱼是杂交可育的两个近缘种 ,这一杂交体系不仅为数量性状的表型带来最大的变异 ,同时也为基因型的多样性提供了最大的可能性。利用 AF L P、RAPD、微卫星顺序标记、EST以及 DNA单体多样性标记 ,以建立遗传连锁图。旨在克隆抗病基因、生长基因、抗逆基因、以及控制食物转化率、产肉率、收获率数量性状的基因。另外还对于适合于鲶鱼基因组研究的 DN A指纹技术进行了评估。并通过极端表型、基因型的分析鉴定出了与生长速度、食物转化率及抗病性有连锁的遗传标记。使用基因型分析、辐射细胞溶合及 BA C基因库 ,以建立斑点鲶鱼的遗传连锁图及物理图 ,并用基因薄膜技术、基因芯片技术 ,以进一步掌握在特定生理条件下的基因调控     

基于基因组学的作物种质资源研究:现状与展望

作物种质资源工作涉及面很广,包括种质资源的收集、编目、保护、繁种更新、分发利用与信息系统建立等基础性工作,作物起源、驯化与传播、种质分类、民族植物学与传统知识研究等基础研究,遗传多样性评价、重要性状表型鉴定、种质资源基因型鉴定、基因发掘和种质创新等应用基础研究。经过近百年的努力,种质资源的基础性工作已卓有成效,作物种质资源保护与共享利用体系基本建立。但由于主要基于形态学的传统研究思路和方法存在很多先天不足,种质资源基础研究和应用基础研究一直举步维艰,效率低下。随着分子标记技术和第二代测序技术的快速发展,基因组学理论和方法不断深入到种质资源研究的多个层面,使种质资源保护和创新利用发生了研究思路和方法学上的变革。基因组学研究成果为种质资源的有效收集和保护提供了理论指导,也为阐明作物起源和演化、全面评估种质资源结构多样性提供了核心理论和技术,同时大幅度提高了基因发掘和种质创新效率。特别是全基因组测序、重测序和简化基因组测序技术不断成熟,使在全基因组水平上比较不同种质资源基因组变异成为可能;在此基础上,可阐明农作物起源以及驯化、改良和传播对种质资源形成的影响,明确现有种质资源和野外种质资源群体结构和遗传多样性,提出种质资源异地保存和原生境保护的最佳策略;结合表型鉴定数据,利用连锁分析和关联分析等基因组学方法,可高效发掘种质资源中蕴含的新基因和有利等位基因,提出其利用途径和具体方案,并在种质创新过程中充分利用基因组学研究成果提高创新效率。文章评述了基因组学在种质资源研究中的应用现状,特别是在种质资源基因型鉴定、异地保存和原生境保护、作物起源与进化研究、结构多样性分析、新基因发掘和种质创新等方面的应用情况及其发展趋势。提出了今后的发展方向和工作重点,强调把基因组学理论和方法与作物种质资源研究紧密结合,为种质资源的有效保护和高效利用提供强有力的理论、技术、材料与信息支撑。     

基于GBS技术开展柚类资源群体遗传评价并发掘酸含量相关基因

【目的】弄清我国柚类种质资源的起源与演化、群体遗传结构和多样性水平，高效利用柚类自然资源群体发掘与果实重要品质性状相关的基因，为柚类种质资源群体的遗传结构研究、起源演化和柚类种质创新提供重要的理论及实践依据。【方法】利用国家果树种质重庆柑橘资源圃中保存的具有广泛遗传多样性和不同地理来源的282份柚类资源作为材料，采用Eco R I限制性内切酶消化基因组DNA后构建GBS文库，然后进行Illumina HiSeq PE150二代测序获得短读序列，通过BWA软件将序列映射到柚参考基因组上，利用SAMTOOLS软件鉴定SNP位点。依据SNP的基因分型结果，进行主成分分析和群体结构分析,并采用邻接法构建系统演化树，分析亚群的遗传多样性水平。选择23个低酸种质和32个高酸种质构成两个群体进行Fst、XP-CLR分析，同时利用282个柚类种质的基因型数据与果实可滴定酸含量的表型数据进行GWAS全基因组关联分析。【结果】利用GBS简化基因组测序技术对282份柚类种质进行测序，获得201.66 Gb的原始测序数据，每个样本的平均测序数据量为0.72 Gb，经过测序深度为5×次要等位基因频率>0....