抗菌肽NZ2114对来源于奶牛乳房炎的无乳链球菌及其生物膜的消杀作用

为探究抗菌肽NZ2114对无乳链球菌的体外抑制效果和相关机制,本试验以无乳链球菌ATCC 13813为研究对象,通过最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）、杀菌动力学、抗生素后效应和电镜学试验对抗菌肽NZ2114杀菌特性和杀菌机制进行评价,并进一步分析其对无乳链球菌生物膜和持留菌的抑制和消除作用。结果显示,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的MIC为0.23 μmol/L,对3株奶牛乳腺炎临床分离菌株CAU-FRI 1、2和3的MIC均为0.11 μmol/L,万古霉素对以上4株受试菌株的MIC值均为0.67 μmol/L,因此NZ2114的抗菌活性是万古霉素的2.91和6.09倍。同时,2×MIC、4×MIC浓度的NZ2114可在0.5 h内杀灭99.9%细菌,且持续药效作用可达270 min。扫描电镜结果显示,NZ2114处理后,细菌表面出现皱缩甚至破裂,细菌产生的生物膜消除。NZ2114在2×MIC下,24 h对早期生物膜抑制率为99.9%;在32×MIC下,24 h对成熟生物膜消除率达99.9%。此外,NZ2114在16×MIC时,对生物膜内的菌体具有99.9%以上的杀灭效果;万古霉素无法清除的持留菌经0.5×MIC的NZ2114处理后,也可以达到99%以上的消除率。激光共聚焦结果显示,NZ2114处理后的生物膜厚度从28.48 μm减少到10.32 μm,证明了其强效杀菌和抑制生物膜的作用。上述结果表明,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813杀菌活性高、速度快、抑制/去除生物膜能力强,并对膜内菌及持留菌具有高效杀菌作用,且作用显著高于万古霉素。因此,NZ2114具有开发成为治疗由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌细胞膜、基因组和耐药性的影响

本试验以真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114和奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌为研究对象,旨在阐明抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的体外抗菌机制及其阻遏金黄色葡萄球菌耐药性的效果。通过16S rRNA基因鉴定对55份乳房炎奶样中的病原菌进行分离鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过微量稀释法测定抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,借助流式细胞术和扫描电镜观察抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌细胞膜完整性及细胞形态的影响,通过凝胶阻滞和圆二色谱分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响,将抗菌肽NZ2114与金黄色葡萄球菌共同孵育以研究抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌耐药性的影响,通过PCR进一步分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌携带的耐药基因的影响。结果表明,共获得10株金黄色葡萄球菌,分离菌对青霉素等9种抗菌药具有耐药性,且50%为多重耐药。抗菌肽NZ2114对10株金黄色葡萄球菌具有强抑菌活性,最小抑菌浓度（MIC）为0.5~1.0 μg/mL。抗菌肽NZ2114可导致金黄色葡萄球菌S7细胞皱缩、细胞内容物泄漏,甚至细胞裂解,碘化丙啶（PI）细胞膜穿透率达5%,且抗菌肽NZ2114可与金黄色葡萄球菌S7基因组DNA结合并改变其DNA结构。金黄色葡萄球菌与1/4×MIC抗菌肽NZ2114孵育12 h后发现,除对阿莫西林和磺胺异噁唑的耐药率没有降低外,对其他抗菌药的耐药率均有不同程度的降低（10%~40%）,且抗菌肽NZ2114对β-内酰胺类耐药基因（blaZ）及杆菌肽类耐药基因（braRS）的消除率分别达28.57%（2/7）和22.22%（2/9）。上述结果证明,抗菌肽NZ2114对耐药金黄色葡萄球菌具有体外强抑菌活性,其干扰耐药金黄色葡萄球菌细胞膜并结合胞内DNA的作用机制为其低耐药杀菌机制奠定了细胞学基础。同时抗菌肽NZ2114对耐药菌株的耐药性及相关耐药基因均有一定消除作用。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的抗生素替代品。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌细胞膜、基因组和耐药性的影响

本试验以真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114和奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌为研究对象,旨在阐明抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的体外抗菌机制及其阻遏金黄色葡萄球菌耐药性的效果。通过16S rRNA基因鉴定对55份乳房炎奶样中的病原菌进行分离鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过微量稀释法测定抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,借助流式细胞术和扫描电镜观察抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌细胞膜完整性及细胞形态的影响,通过凝胶阻滞和圆二色谱分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响,将抗菌肽NZ2114与金黄色葡萄球菌共同孵育以研究抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌耐药性的影响,通过PCR进一步分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌携带的耐药基因的影响。结果表明,共获得10株金黄色葡萄球菌,分离菌对青霉素等9种抗菌药具有耐药性,且50%为多重耐药。抗菌肽NZ2114对10株金黄色葡萄球菌具有强抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)为0.5～1.0μg/mL。抗菌肽NZ2114可导致金黄色葡萄球菌S7细胞皱缩、细胞内容物泄漏,甚至细胞裂解,碘化丙啶(PI)细胞膜穿透率达5%,且抗菌肽NZ2114可与金黄色葡萄球菌S7基因组DNA结合并改变其DNA结构。金黄色葡萄球菌与1/4×MIC抗菌肽NZ2114孵育12 h后发现,除对阿莫西林和磺胺异噁唑的耐药率没有降低外,对其他抗菌药的耐药率均有不同程度的降低(10%～40%),且抗菌肽NZ2114对β-内酰胺类耐药基因(blaZ)及杆菌肽类耐药基因(braRS)的消除率分别达28.57%(2/7)和22.22%(2/9)。上述结果证明,抗菌肽NZ2114对耐药金黄色葡萄球菌具有体外强抑菌活性,其干扰耐药金黄色葡萄球菌细胞膜并结合胞内DNA的作用机制为其低耐药杀菌机制奠定了细胞学基础。同时抗菌肽NZ2114对耐药菌株的耐药性及相关耐药基因均有一定消除作用。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的抗生素替代品。     

锦州地区某奶牛场乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及抗菌肽NZ2114对分离菌株细胞膜和耐药性的研究

自2017～2019年采集锦州地区某规模化牛场患有乳房炎的奶牛乳样150份,进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定,并使用抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌进行抑菌活性检测。结果显示:试验共分离得到金黄色葡萄球菌48株,总分离率为32%;抗菌肽NZ2114对于金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性,对于葡萄球菌细胞膜有一定的破坏作用;经过抗菌肽NZ2114处理后相关病菌体对于部分抗生素敏感性有所提高。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的杀菌作用研究

为探究真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的体外杀菌效果及其作用机制,本试验采用微量肉汤稀释法检测停乳链球菌CVCC 3938耐药性,通过NZ2114对停乳链球菌CVCC 3938最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及在胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基和全脂灭菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization,UHT)牛奶中的杀菌动力学曲线的测定评价其抗菌特性;借助扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪观察NZ2114作用下的细菌形态变化;使用凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱进一步分析NZ2114对细菌基因组DNA的作用。结果显示,停乳链球菌对氧氟沙星和四环素均产生耐药性,临床分离菌株则呈现多重耐药性,NZ2114对受试停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的MIC值为0.11～0.45μmol/L。抗菌肽在TSB培养基和全脂灭菌牛奶中均具有抑菌活性,且在短时间内(0.5～3 h)可使停乳链球菌菌落数下降3个数量级。扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪结果表明,抗菌肽NZ2114能够破坏停乳链球菌细胞膜,导致其内容物泄漏。凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱证实抗菌肽穿过细胞膜后与细菌基因组结合,破坏了DNA,以此达到杀菌目的。上述结果表明,抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌杀菌活性强,其破坏菌体细胞膜后可直接作用于胞内的基因组DNA并改变其二级结构。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗停乳链球菌引起乳腺炎的抗生素替代品。     

我国奶牛乳房炎无乳链球菌抗生素耐药性研究

为了查明我国奶牛乳房炎无乳链球菌对抗生素耐药情况,指导临床合理用药,从我国部分地区奶牛场采集的临床型奶牛乳房炎病乳中分离鉴定出无乳链球菌115株,采用K-B纸片法测定了这些菌株对抗生素的耐药情况。结果表明,无乳链球菌对目前临床上使用的大部分抗生素,如头孢唑啉、头孢噻肟、丁胺卡那霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、强力霉素、麦迪霉素、林可霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、环丙沙星、氟哌酸、氨苄青霉素/舒巴坦、头孢噻肟/棒酸和头孢他啶/棒酸均比较敏感;但对青霉素G、氨苄青霉素、链霉素、恩诺沙星、阿莫西林/棒酸和复方新诺明等有一定耐药性,其耐药率达50%～100%。     

Nisin抗菌肽治疗奶牛无乳链球菌性隐性乳房炎后主要乳成份的变化

将36头无乳链球菌引起的隐性乳房炎奶牛分成试验组和对照组,每组18个病例.试验组奶牛用Nisin抗菌肽经患病乳房内灌注,每天1次,连续治疗3 d,对照组奶牛不治疗.分别采集治疗前和治疗后1、3、5周的奶样进行细菌学检查,体细胞含量测定和乳成份分析.结果表明,经Nisin治疗后,细菌阳性乳区数和体细胞教(SCC)大于500 000/mL乳区数量均显著降低,牛奶中脂肪、蛋白质、乳糖和总固体含量有升高趋势,尤其是蛋白质和乳糖的含量显著高于治疗前.由此可见,Nisin乳房内注入对于奶牛无乳链球菌性隐性乳房炎具有良好的治疗作用.     

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离与鉴定

利用THB固体培养基和色素培养基初步筛选出奶牛乳房炎中无乳链球菌,以分离的12株疑似菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,对扩增产物进行分析,结合选择培养的生理生化特性对分离菌进行鉴定。结果表明,12株疑似菌中有8株为无乳链球菌.     

抗菌肽NZ2114对多重耐药2型猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价

为探究抗菌肽NZ2114对猪链球菌感染小鼠模型的体内治疗效果,本试验以NZ2114和2型猪链球菌CVCC 3928为研究对象,利用小鼠模型评价NZ2114治疗猪链球菌感染的效果。36只ICR雌鼠随机均分为6组：空白对照组（不感染,腹腔注射0.2 mL PBS）、阴性对照组（感染,腹腔注射0.2 mL PBS）、试验Ⅰ和Ⅱ组（感染,分别腹腔注射0.2 mL 2.5和5.0 mg/kg NZ2114）、阳性对照Ⅰ和Ⅱ组（感染,分别腹腔注射0.2 mL 7.5和15.0 mg/kg头孢曲松钠）。结果显示,空白对照组和5.0 mg/kg NZ2114试验组小鼠存活率均为100%,而15.0 mg/kg头孢曲松钠阳性对照组小鼠存活率仅为50%。治疗1 d后,5.0 mg/kg NZ2114试验组小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降59.41%（P < 0.01）和69.19%（P < 0.01）;而15.0 mg/kg头孢曲松钠阳性对照组中小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降43.94%（P < 0.01）和19.60%（P < 0.05）。与阴性对照组相比,2.5 mg/kg NZ2114治疗组中抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的释放分别下降85.83%（P < 0.01）和56.20%（P < 0.05）,5.0 mg/kgNZ2114试验组分别降低84.02%（P < 0.01）和43.86%（P < 0.05）,而15.0 mg/kg头孢曲松钠阳性对照组TNF-α及IL-1β的下降率均不显著,分别为24.49%和8.82%。另外,5.0 mg/kg NZ2114试验组1 d后即可明显减轻小鼠肺组织间质弥漫性炎细胞浸润等炎症症状,抑制肝细胞产生肿胀及空泡性变化,促进脾小结恢复正常;治疗7 d后各器官组织临床症状评分基本恢复正常。上述结果表明,NZ2114能有效提高猪链球菌感染小鼠的存活率,显著降低病原菌在小鼠肺脏和肝脏的移位及血清中TNF-α和IL-1β的水平,并有效缓解肝脏、脾脏和肺脏的急性损伤,治疗效果优于头孢曲松钠,具有作为治疗临床猪链球菌病抗生素替代品的潜力。     

多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用

参照GenBank发表的序列，在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16SrRNA与23SrRNA之间的区域设计了3对引物，参照念珠菌和隐球菌的18SrRNA的序列设计1对引物，建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染l临床标本。结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性，多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为10^4CFU／mL，检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为10^4CFU／mL、10^3CFU／mL和10^3CFU／mL。通过对采自临床型乳腺炎（46个）和隐性乳腺炎（167个）动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测，多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率（P〈0．01），但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著（P〉0．05）。     

无乳链球菌检测及其奶牛乳腺炎防治的研究进展

本文就近年来国内外在无乳链球菌的鉴定、检测方法、防御等方面的研究进展进行了系统性的综述,为控制该病原微生物的传播、蔓延和由无乳链球菌引起的奶牛乳腺炎的防治提供参考。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）属于B群链球菌,是影响人畜健康的重要病原微生物之一。它可以引起新生儿脑膜炎、肺炎、败血病等,又是奶牛乳腺炎的主要病原体之一,给奶牛业造成了巨大的损失。     

新型黏虫抗菌肽AAP-1对大肠杆菌的抗菌作用

为评价一种新型黏虫抗菌肽（armyworm antimicrobial peptide 1,AAP-1）的抗菌活性,本试验首先采用固相化学合成法合成AAP-1,并通过高效液相色谱纯化和质谱检验,用抑菌圈法测定AAP-1对大肠杆菌的抗菌效果,倍比稀释法检测最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,细菌平板计数法测定时间抗菌曲线;最后,通过超微量分光光度计评价AAP-1对大肠杆菌核酸泄露的影响,核酸凝胶电泳评价AAP-1对大肠杆菌胞内DNA的影响,透射电子显微镜观察评价AAP-1对大肠杆菌的整体作用效果。结果表明,合成的AAP-1纯度高于98%,分子质量为4 262.17 u;AAP-1对大肠杆菌具有良好的抗菌活性,MIC为7.8 μg/mL;对大肠杆菌的抗菌作用具有浓度依赖性,且在60 min内抗菌效果逐渐增强;AAP-1能够导致大肠杆菌核酸泄露,致使胞内DNA总量减少,且呈现浓度依赖性;AAP-1也会导致大肠杆菌细胞膜破坏、胞内电子密度明显降低、胞质溶解等现象。综上,本研究化学合成了一种新型抗菌肽AAP-1,且纯度高达98%,其对大肠杆菌具有良好的抗菌效果。本研究可为深入研究AAP-1对大肠杆菌的抗菌机制提供前期数据,可为APP-1的临床应用奠定理论基础。     

Antibacterial Effect of Novel Armyworm Antimicrobial Peptide (AAP-1) Against Escherichia coli

In order to evaluate the bactericidal activity of a novel armyworm antimicrobial peptide (AAP-1),the bactericidal effect of AAP-1 on Escherichia coli (E.coli) was investigated.Firstly,AAP-1 was synthesized by solid-phase chemically synthesis,and purified by high-performance liquid chromatography and tested by mass spectrometry.Then,the bactericidal effect of AAP-1 against E.coli was determined by the bacteriostatic circle method.The minimum inhibitory concentration (MIC) was detected by the double dilution method.The time kill curve was measured by bacterial plate counting method.Finally,the effect of AAP-1 on the nucleic acid leakage of E.coli was evaluation by ultra-micro spectrophotometer.The effect of AAP-1 on the intracellular DNA of E.coli was tested by nucleic acid gel electrophoresis.The overall effect of AAP-1 on E.coli was observed through transmission electron microscope.The results showed that the purity of the synthesized AAP-1 was more than 98%,and its molecular weight was 4 262.17 u.AAP-1 showed good antibacterial activity against E.coli,with a MIC of 7.8 μg/mL.AAP-1 had a concentration-dependent bactericidal effect on E.coli,and within 60 min the bactericidal effect gradually increased.AAP-1 could cause the nucleic acid leakage of E.coli,and resulted in a reduction in the total amount of intracellular DNA of E.coli with concentration-dependent.AAP-1 could also cause cell membrane destruction,significantly reduce intracellular electron density,resulted in cytoplasmic dissolution of E.coli,and so on.In summary,this study suggested that a novel antimicrobial peptide AAP-1 could be chemically synthesized with a purity of up to 98% and showed its good bactericidal effect on E.coli.This study could provide preliminary data for the in-depth study of the bactericidal mechanism of AAP-1 against E.coli and laid a theoretical foundation for the clinical application of AAP-1.     

抗菌肽对抗生素耐药菌株的抑菌活性研究

[目的]研究抗菌肽对抗生素耐药菌株的抑菌活性。[方法]利用抗性平板划线法从腹泻病牛血便中筛选分离出1株耐药菌,通过16S rDNA序列进行鉴定,采用琼脂孔穴扩散法通过梯度盐酸壮观霉素（spectinomycin,Spe⁺）、氨苄青霉素（ampicillin,Amp⁺）、硫酸卡那霉素（kanamycin,Kan⁺）和氯霉素（chloramphenicol,Cm⁺）试验确定该菌药敏特性,并利用1种抗菌肽制剂对该菌株进行药敏试验。[结果]经BLAST比对分析该菌16S rDNA序列,鉴定该耐药菌为科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）,此菌对Amp⁺敏感,但对试验中其他抗生素均有耐药性,各梯度抗菌肽对该耐药菌均具有明显的抑菌活性。[结论]抗菌肽能有效抑制耐药科氏葡萄球菌的生长,有望在畜牧生产中代替抗生素使用。     

生物抗菌肽的研究现状

抗菌肽为生物机体内天然免疫系统的重要组成部分,具有抗细菌、抗病毒、抗真菌等多种生物学活性。抗菌肽或者类似物主要通过使细胞膜通透性增大而抑制或者杀死靶细胞,具有作为新型抗生素和食品添加剂的潜在应用前景。不同抗菌肽之间、抗菌肽与传统抗生素具有协同效应,这在一定程度上拓宽了抗菌肽的应用范围。