HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定

【目的】菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默(HIGS)的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS)为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H2O2的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS(SS1G_00102)全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点(PI)为5.04,与灰霉病菌BcCCS(EDN25358)亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS(AT1G12520.1)亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T1及T2代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T2代中获得3个稳定表达的T3代HIGS-CCS转基因拟南芥株系:HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H2O2的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。     

茅苍术菌核病病原菌分离鉴定

明确茅苍术的菌核病种类和系统发育学特征,为茅苍术菌核病防治提供参考。从茅苍术种植基地采集感病植株进行病原菌分离、纯化,按照柯赫氏法则进行致病性验证及再分离培养,采用形态学观察及ITS、G3PDH和HPS60三基因核酸序列分析对病原菌进行鉴定。根据形态学和多基因系统发育分析,经鉴定茅苍术菌核病病原菌为核盘菌Sclerotinia sclerotiorum。     

山西省红芸豆菌核病病原菌鉴定

菌核病是山西省红芸豆产区的一种重要病害,为明确其病原菌种类,通过组织分离法、致病性测定、形态学和分子生物学鉴定相结合的方法,对山西省红芸豆菌核病病原菌进行分离鉴定。结果表明：在PDA培养基上,病原菌菌丝初期呈白色絮状,培养7 d后在菌落边缘出现黑色鼠粪状菌核,菌核直径2.0~4.5 mm,菌核萌发产生1～3个子囊盘;子囊呈圆柱形或梭形,大小为（120.0～140.5）μm×（9.2～11.6）μm;子囊内含8个无色、椭圆形子囊孢子,大小为（8.4～12.0）μm×（4.0～5.5）μm。代表菌株J8-1.8可侵染红芸豆茎部和豆荚引起发病。以rDNA-ITS基因序列构建的系统发育树中,J8-1.8与核盘菌Sclerotinia sclerotiorum聚为一支。结合形态学特征和分子生物学方法,确定引起山西省红芸豆菌核病的病原菌为核盘菌Sclerotinia sclerotiorum。     

大白菜菌核病抗性鉴定方法研究

【目的】探讨鉴定大白菜菌核病抗病性的简易方法,为大白菜抗菌核病育种提供借鉴。【方法】以大白菜菌核病样病原菌为接种体,选用抗病品种15S261和15S94、耐病品种14S474和14S265及感病品种14S406、15S64和17S20为试验材料,对大白菜离体叶片和活体幼苗进行抗病性鉴定,并对离体叶片的接种时期、发病温度、接种部位及活体幼苗的接种时期、接种量进行比较,最后利用离体叶片接种法对89份大白菜种质资源进行菌核病抗病性鉴定。【结果】大白菜离体叶片抗病性鉴定的最适接种苗龄为4叶期,最适宜接种部位为叶片正面,最佳发病温度为25℃;活体幼苗抗病性鉴定的最适接种量为直径5 mm的菌丝琼脂块,最适接种苗龄为3叶期。在89份被鉴定的大白菜种质材料中,23份材料表现抗病,38份材料表现耐病,21份材料表现感病,7份材料表现高感。【结论】离体和活体菌丝琼脂块接种方法均能准确鉴定出大白菜的抗病性,其中离体菌丝琼脂块法更经济适用;大白菜种质资源中存在着抗病和耐病材料,可用于抗(耐)菌核病品种的选育。     

SEC11基因的HIGS表达载体构建及转基因水稻的抗病性分析

[目的]为克服传统抗病水稻材料抗病性易于丧失的缺点.[方法]利用寄主诱导基因沉默(HIGS)技术创制水稻抗稻瘟菌的新材料.[结果]首先,选取稻瘟菌信号肽复合物中的关键亚基SEC11为靶基因,利用Gateway基因重组技术将稻瘟菌SEC11基因的干扰片段构建到pBDL03载体上获得HIGS表达载体.通过农杆菌介导的转化法...     

RHO1基因的HIGS表达载体构建及转基因水稻的抗病性分析

【目的】使用Gateway技术构建稻瘟菌RHO1基因寄主诱导的基因沉默(HIGS)表达载体,将其转化入水稻后,观察稻瘟菌对转基因水稻的致病力。【方法】利用PCR技术从稻瘟菌cDNA扩增RHO1基因,通过Gateway技术构建pBDL03-RHO1载体,电转化进入农杆菌AGL1;以水稻日本晴为材料,通过农杆菌介导的转化方法获得转基因水稻植株,并对其接种稻瘟菌,分析转基因水稻对稻瘟菌抗性。【结果】通过PCR扩增获得了RHO1基因片段,利用BP反应构建了入门载体pDONR 221-RHO1,采用LR反应构建了HIGS表达载体pBDL03-RHO1。通过农杆菌介导的转基因方法将HIGS载体转入了水稻中,并利用mCherry红色荧光观察和PCR扩增验证了转基因植株构建成功。接种试验结果表明,HIGS转基因植株对稻瘟菌的抗性提高。【结论】利用Gateway技术可以简单快速构建HIGS表达载体,表达RHO1的转基因水稻抗病性提高,表明RHO1介导的HIGS在水稻-稻瘟菌互作过程中可以发挥作用。     

Transformation of Arabidopsis thaliana via Agrobacterium tumefacience with an endochitinase gene from Trichoderma, and enhanced resistance to Sclerotinia sclerotiorum

Sclerotinia sclerotiorum is an important pathogen to many crops and is especially damaging to rape in China. As a model plant Arabidopsis thaliana (Col0) was transformed by spraying Agrobacterium tumefacience with Trichoderma endochitinase gene ThEn-42 at initial bud stage. Eleven seedlings (corresponding to about 0.22 percent transformation) exhibited resistance to hygromycin. The DNA fragment unique to endochitinase (ThEn-42) was amplified by Arabidopsis leaf-PCR or genomic DN…     

拟南芥抗菌核病突变体275-7的初步研究

草酸是核盘菌致病过程中产生的毒素因子。以菌核病菌毒素草酸（3 mmol/L）为筛选压,从1 000个拟南芥T-DNA插入突变体中筛选出了1个草酸不敏感突变体,命名为275-7。通过拟南芥活体接种对突变体275-7进行菌核病抗性鉴定,与野生型相比,突变体275-7对菌核病的抗性显著增强（P<0.05）;荧光定量PCR检测结果表明,275-7中茉莉酸途径的标志基因PDF1.2的表达量是野生型的12倍,而水杨酸途径的标志基因PR1基因的表达量与野生型比较无差异。推测拟南芥突变体275-7可能通过增强水杨酸介导的防卫反应,从而表现出对菌核病的抗性。     

农杆菌介导木霉几丁质酶基因转化拟南芥及其T1代对油菜菌核病抗性提高

通过根癌农杆菌介导花期喷雾，将内切几丁质酶基因导入拟南芥哥伦比亚生态型的野生型植株中，转化的种子经潮霉素抗性筛选，获得抗性幼苗11棵，转化频率为0．22％，经叶片PCR或基因组DNAPCR，扩增出外源基因ThEn42的特异性DNA片断，当代植株表现出不育、矮化和生长发育正常等不同表型。接种油菜菌核病菌(Sclerptinia sclerotiorum)后，T1代植株对病菌抗性显著提高。     

芸芥(Eruca sativa Mill.)对菌核病的抗性研究

 经对芸芥和甘蓝型油菜进行苗期菌丝块接种鉴定和花期带菌牙签鉴定表明,芸芥品种总体抗性水平高于甘蓝型油菜。所鉴定的32个芸芥品种中,抗病品种22个,占供试品种68.8％,感病品种10个,占供试品种31.2％,没有中感和高感品种。所鉴定的32个甘蓝型油菜品种中,抗病品种10个,占供试品种的31.3％,感病品种22个,占供试品种的68.8％。在芸芥中有毛类型与无毛类型有一定差异,有毛类型抗性较强。当接种菌核菌后,芸芥体内酚类物质含量迅速增加,36h后达较高水平,以后略有升高。     

拟南芥CYP76C2基因(At2g45570)的克隆及其菌核病抗性功能分析

以拟南芥基因组DNA为模板,扩增出细胞色素P450(CYP76C2)基因的ORF,成功构建了CYP76C2基因的过表达载体并获得转基因植株.通过离体和活体接种表明,CYP76C2基因的过表达植株对核盘菌的抗性增强.     

四川省核盘菌的营养体亲和性

为掌握四川省核盘菌的种群多样性并为抗病育种提供依据,选取了四川省10个地区的23个县(市)和不同寄主的80个代表菌株,在改良Patterson氏培养基(MP培养基)上两两配对,进行营养体亲和性测定。结果显示,80个供试菌株可划分为63个菌丝体亲和群(MCGs),其中52个菌丝体亲和群(MCGs)是由单个仅与自身亲和的菌株组成,最大的菌丝体亲和群(MCGs)也仅含有4个菌株,同一亲和群(MCGs)内的菌株与不同亲和群菌株配对的表现型也不完全相同。表明四川核盘菌种群内存在较大的遗传异质性。     

咪鲜胺锰盐防治油菜菌核病的潜力研究

【目的】研究比较核盘菌对咪鲜胺锰盐和其余3种杀菌剂的敏感性,探讨咪鲜胺锰盐防治油菜菌核病的潜力,筛选菌核病防治新药剂。【方法】实验室测定不同杀菌剂对核盘菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用及其保护作用和治疗作用,田间评价其防治油菜菌核病的潜力。【结果】核盘菌对杀菌剂咪鲜胺锰盐高度敏感,而对多菌灵、多·酮和菌核·锰锌敏感性稍差。咪鲜胺锰盐抑制核盘菌菌丝生长的抑制中浓度(EC50)为0.02mg·L-1。浓度为20mg·L-1的咪鲜胺锰盐可以延缓核盘菌菌核萌发出菌丝。浓度为0.5g·L-1咪鲜胺锰盐对菌核萌发成子囊盘百分率的抑制率达82.9%。咪鲜胺锰盐对油菜菌核病兼有保护作用和治疗作用,可以抑制核盘菌的侵染以及侵染后病斑的扩展。咪鲜胺锰盐在田间条件下对油菜菌核病的防效达88.1%。【结论】咪鲜胺锰盐是一种很有潜力的油菜菌核病防治药剂。     

Reaction of Oilseed Rape Cultivars to Sclerotinia Stem Rot in Field Environments

Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, as an ubiquitous phytopathogenic Ascomycete fungus capable of infecting a wide range of plants, has increased in importance for oilseed rape production worldwide in recent years. The objective of this research was to determine the effectiveness of two measurements of disease rating in predicting the field reaction of cultivars to sclerotinia stem rot. One hundred and ten cultivars or lines of oilseed rape were repeatedly evaluated the disease severity index (DSI) and lesion length for their resistance to nine isolates of S. sclerotiorum in two field stations.There were greatly significant differences between two stations, among isolates, among population of cultivars for the disease severity index and lesion length, and also significant station×isolate interaction for lesion length and population×isolate interactions for DSI and lesion length, but interactions of station×isolate for DSI were not significant.Cultivars such as Pomorzanin and Lisek consistently had the lowest disease severity ratings in the field tests. However,most of cultivars were susceptible to sclerotinia stem rot in the field test. A positive correlation between the mean DSI and lesion length was found for both isolates (Sc23 and B1). The correlations ranged from 0.23 to 0.83 at various plots, with nine of the twelve correlations significant. The correlations for disease caused by different fungal isolates were statistically significant difference. These correlations ranged from -0.44 to 0.90, with nine of the thirty-two correlations significant. It indicated that resistance to some isolates was significantly correlated and selection of some varieties for resistance to one isolate appeared to improve resistance to other isolates.     

转TaCRT基因拟南芥植株表型分析及抗性鉴定

为了进一步揭示小麦钙网蛋白基因TaCRT是否参与植物对环境胁迫响应,通过根癌农杆菌GV3101介导法将该基因cDNA克隆转入拟南芥,使其异源过量表达,分析转基因拟南芥纯系和野生型植株在表型上的差异,并对转基因株系的抗盐性进行鉴定。结果表明,过表达TaCRT基因的拟南芥纯系植株在正常培养条件下,植株生长相对旺盛,根系较短,分化的不定根数目较多,而在盐胁迫条件下,与野生型相比,转基因株系的耐盐性较强。     

相对抗性指数在大豆种质资源抗菌核病鉴定中的应用

为了客观反映大豆种质资源对茵核病的抗病水平,排除环境、土壤、年份、生态区和接种方法等因素的影响,采用相对抗病指数作为抗病指标,于2011年在黑龙江省农业科学院佳木斯分院的盆栽场及病圃内进行了大豆种质资源抗茵核病的鉴定。结果表明：筛选出抗病品种2份,占试验材料的3．2％;中抗品种1份占所鉴定材料的1．61％,低抗品种29份占所鉴定材料的46．77％,低感品种20份占所鉴定材料的32．26％,中感品种6份占所鉴定材料9．68％,高感品种4份占所鉴定材料的6．45％。试验结果为大豆菌核病抗原大规模准确筛选奠定了基础。