芒硝对驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响

为研究不同浓度的芒硝对体外培养的驴皮成纤维细胞增殖、凋亡的影响,本试验采用组织块法体外培养驴皮成纤维细胞,并用HE、Masson染色鉴定;再添加高(2 000、1 500μg/mL)、中(1 000、500、250μg/mL)和低浓度(100、50、10μg/mL)芒硝体外培养驴皮成纤维细胞,用MTT和Caspase-3法分别检测成纤维细胞增殖率和凋亡率;最后用实时荧光定量PCR、ELISA法检测不同浓度(1 500、250、10μg/mL)芒硝培养液中影响驴皮成纤维细胞胶原蛋白合成的相关基因表达量及蛋白浓度。结果显示,培养5 d时,驴皮成纤维细胞开始从组织块边缘爬出,25 d后长满培养皿;HE染色呈典型的梭形,驴皮成纤维细胞中胶原纤维经Masson染色呈蓝色。中浓度芒硝培养液组成纤维细胞的增殖率显著高于高、低浓度组(P0.05),相应地,中浓度组的凋亡因子Caspase-3活性显著低于其他两组(P0.05)。相比于24 h,芒硝作用于成纤维细胞48 h能显著提高胶原蛋白合成相关基因的表达量(P0.05),250μg/mL浓度的效果最佳。综合上述结果,组织块培养法易于分离培养驴皮成纤维细胞,250μg/mL浓度的芒硝在48 h能显著提高驴皮成纤维细胞的增殖率及其胶原蛋白合成相关基因的表达量,此结果可为芒硝促进驴皮成纤维细胞的增殖作用以及驴皮伤口愈合机制的研究提供理论依据。     

广灵驴成纤维细胞系的建立及其相关生物学特性研究

试验旨在建立广灵驴成纤维细胞库,以期在细胞水平上对广灵驴进行保护。本研究以1月龄广灵驴耳缘皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞培养,建立了广灵驴耳缘皮肤组织成纤维细胞系,并对其相关生物学特性进行了鉴定。结果发现,试验所建立的广灵驴成纤维细胞系大多数细胞呈长梭形,部分细胞呈三角状或星型。在培养过程中,广灵驴原代成纤维细胞在贴壁4 d时开始有细胞从组织边缘游离出来,贴壁14 d后,细胞汇合率达到80%,可以进行第一次传代培养;细胞生长态势良好,生长曲线呈典型的S型曲线;细胞冻存复苏后活率有所下降,但生长状态良好。细胞分裂中期染色体数2n=62,说明成功建立了广灵驴成纤维细胞系。通过本方法建立的广灵驴成纤维细胞系为后续广灵驴的相关研究奠定了基础。     

新疆驴成纤维细胞原代培养及鉴定

为了获得纯度较高的驴皮成纤维细胞并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采用组织块贴壁法进行原代细胞培养,用胰蛋白酶联合组织块进行差时消化法分离、纯化成纤维细胞,并通过细胞形态观察、PCR扩增鉴定vimentin、免疫荧光染色法鉴定分离的细胞并计算纯度,用CCK-8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存前后的细胞活率。结果表明：分离纯化后的细胞呈梭形或纺锤形,具备典型的成纤维细胞形态;PCR扩增可清晰检测到vimentin的表达条带;细胞免疫荧光显示vimentin染色为阳性,DAPI核染呈椭圆形,以上方法均鉴定为成纤维细胞;体外培养的驴皮第3代成纤维细胞48 h后进入对数生长期,其生长曲线呈“S”型;冻存前和复苏后细胞活率差异不显著(P>0.05)。说明经体外分离、纯化成功获得了驴皮成纤维细胞。     

镉对鸡胚成纤维细胞增殖和凋亡的影响

以鸡胚成纤维细胞为研究对象,探讨镉影响细胞增殖及凋亡的作用。应用酶标仪、倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪,分析细胞毒性、细胞形态、凋亡率、细胞周期与线粒体膜电位及胞内钙离子稳态。结果表明:镉处理后,细胞活性下降,呈现凋亡形态学变化,细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡率呈浓度和时间依赖性,细胞线粒体膜电位下降,胞内游离钙离子浓度增大。研究发现,镉可通过阻滞细胞周期,降低线粒体膜电位,影响胞内钙离子稳态来诱导鸡胚成纤维细胞凋亡。     

猪SMYD3基因的克隆、序列分析及其对猪成纤维细胞增殖的影响

试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1 404 bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P<0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P<0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P<0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。     

丝裂霉素C对小鼠胎儿成纤维细胞增殖抑制作用的研究

为探讨丝裂霉素C对小鼠胎儿成纤维细胞增殖的抑制作用,用10μg/mL的丝裂霉素C处理昆明白胎鼠P1代成纤维细胞1.5、2、2.5、3、3.5、4 h,用台盼蓝和AO/PI染色法观察细胞死亡情况,MTT测其增殖情况,PCNA染色观察其增殖细胞状态,比较胚胎干细胞接种在冻存过的饲养层细胞与未冻存的饲养层细胞的生长情况.结果表明,丝裂霉素C处理MEF时间小于3 h,不能抑制其生长,处理4 h后,饲养层细胞部分已经没有核仁,部分细胞已经崩解,且胚胎干细胞接种在冻存过的饲养层细胞与未经冻存的饲养层细胞都生长良好.从而得出,10μg/mL的丝裂霉素C处理MEF 3 h,能够抑制细胞增殖,且不引起细胞死亡,能用来作ES细胞的饲养层,且可以冻存、复苏后直接用于培养胚胎干细胞.     

驴皮成纤维细胞的体外培养研究

试验旨在比较不同培养方法对驴皮成纤维细胞培养的效果,以便建立其体外高效快速的培养体系。采集6~7岁健康的新疆驴真皮组织,分别用组织块贴壁法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养,并检测分析细胞的生长特点、生长速度、细胞周期与支原体污染等指标。结果显示,双酶消化法（0.25%胰酶处理1 h,再用0.5%胶原蛋白酶Ⅰ处理6 h）培养驴皮组织3 d后,成纤维细胞进入了对数增殖期,而组织块贴壁法则需要15 d;细胞周期经流式分析发现,处于G0/G1期与S+G2+M期的细胞均约为50%,其余5.17%细胞处于凋亡期,表明大多细胞处于分裂增殖的活跃期,细胞具有很强的活力;试验中培养的细胞均无支原体污染。综上,应用双酶消化法可快速、高效地建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。     

驴皮低温酶解脱毛方法及其对阿胶质量的影响

[目的]开发一种适合阿胶产业化生产的高效驴皮脱毛方法。[方法]低温条件下（4 ℃）,选用1%碱性蛋白酶和1%中性蛋白酶对醒发的干驴皮开展酶解脱毛试验,比较2种酶解方法处理下驴皮的脱毛时间、脱毛率,并对脱毛过程中驴皮的气味进行评价。以1%碱性蛋白酶和1%中性蛋白酶酶解处理驴皮以及机械脱毛鲜驴皮为材料熬制阿胶,比较不同原料熬制阿胶的出胶量、出胶率、外观、气味等;测定以2种蛋白酶酶解处理的驴皮为原料熬制的阿胶质量指标,包括水分、灰分、水不溶物以及4种氨基酸含量,并与《中国药典》2015版一部中提供的相应质量标准进行对比。[结果]低温条件下（4 ℃）,利用1%碱性蛋白酶（pH值=10.5）或1%中性蛋白酶（pH值=7.5）酶解处理驴皮第2天表现出脱毛效果,处理第5天醒发的干驴皮脱毛率可达90%,有臭味产生但非驴皮腐败臭味,而是脱毛过程中产生的正常气味。以1%碱性蛋白酶、1%中性蛋白酶酶解脱毛后的驴皮以及机械脱毛鲜驴皮为原料熬制阿胶,出胶量分别为113.0、109.4、129.3 g,出胶率分别为13.8%、13.1%、13.2%;2种酶解处理驴皮熬制的阿胶色红、气味芳香,与鲜驴皮熬制的阿胶相比色泽更鲜亮。2种酶解处理驴皮熬制阿胶的水分、灰分、水不溶物均符合并优于《中国药典》2015版一部中的质量标准,L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸含量也远高于《中国药典》2015版一部中的质量标准。[结论]低温条件下（4 ℃）,1%碱性蛋白酶和1%中性蛋白酶可对醒发干驴皮进行有效酶解脱毛,且脱毛后驴皮熬制的阿胶质量符合《中国药典》2015版一部标准。     

驴皮货源缺口大 价格猛涨

今年国内阿胶价格大涨，除了国内销售增加外，还大量出口到国外市场。由于生产阿胶的驴皮货源减少，阿胶生产量上不去，出现了市场供不应求的局面，阿胶价大涨，同时也带动了驴皮价格猛涨。     

人端粒酶基因(hTERT)对牛耳成纤维细胞凋亡的影响

为了提高体细胞核移植的效率,试验探讨了转染外源性hTERT基因对核移植供体细胞———牛耳成纤维细胞的影响。试验应用脂质体介导hTERT基因转染,用相差显微镜观察转染前后的细胞状态,用RT-PCR、W estern blot法检测hTERT基因是否整合并表达,用流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化和凋亡的情况,并进行核型分析。结果表明:转染48 h后能看到明显的荧光,经600μg/mLG418筛选后,获得阳性克隆,转染后的细胞形态上基本无变化,hTERT基因整合并表达;经流式细胞仪检测,转染前后生长周期无明显变化,凋亡率极显著降低(P<0.01),核型正常;转染hTERT基因后的牛耳成纤维细胞的凋亡率显著低于未转染的细胞,并且形态正常,表明转染hTERT后,使体外培养的牛耳成纤维细胞生命力得到延长,为核移植提供了数量更多的高质量的核供体细胞。     

Study on in vitro Culture of Donkey Skin Fibroblasts

This study was aimed to compare different culture methods for donkey skin fibroblasts to establish a highly efficient and rapid culture system. The dermal tissue of the healthy and 6-7 year old Xinjiang donkey was cultured for primary cells of skin fibroblast with tissue explants adherent method and double enzyme digestion method. Then,the growth characteristics,proliferation,cell cycle and mycoplasma contamination were detected and analyzed. The results showed that the fibroblast cells entered the logarithmic growth phase after cultured for 3 days by double enzyme digestion(0.25% trypsin digestion for 1 h and then 0.5% collagenase Ⅰ for 6 h), while it required 15 days with tissue explants adherent method. Flow cytometry analysis showed that nearly half of the cells were in G0/G1 stage,the other half in S+G2+M stage, while just 5.17% of the cells were apoptosis,which indicated that most of the cells were in the active stage of division and proliferation,and had strong vitality. Moreover, there was no mycoplasma contamination in the cultured cells. In summary,the culture system of donkey skin fibroblasts was rapidly and effectively established with the double enzyme digestion method in vitro.     

驴骨胶原肽制备方法的初步建立及分子量检测

旨在建立驴骨胶原肽的制备方法,并对其分子量进行检测.以牛血清白蛋白为对照品,建立多肽含量和OD650 nm值的标准曲线方程;模拟人工胃液、肠液环境,以驴骨胶原肽一级、二级酶解产物多肽含量为评价指标,在筛选胃蛋白酶和胰蛋白酶最佳酶解时间和加酶量的基础上,采用二级生物酶解技术制备驴骨胶原肽;应用SDS-PAGE法对制备的驴...     

运输应激对驴血液指标的影响

本试验旨在研究长途运输应激对驴血液指标的影响。试验以12头体重(140.8±5.2)kg的德州驴为研究对象,运输距离约950km,发车地气温为-20℃,目的地气温为-10℃,历时21h,其中包括10次停车观察(≤20min)。分别在运输前、运输后0h和运输后3、5、7、9、15d采集颈静脉血15mL,进行血液激素指标、血常规指标和血液生化指标检测,并分别记录运输前、运输后0h和运输后10、20、30d体重。结果显示,与运输前相比,落地后0h血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)、热休克蛋白90(HSP90)和皮质醇(cortisol)浓度均显著升高(P<0.05),落地后3、5、7、9、15d内逐渐降低,ACTH和HSP90基本恢复至运输前水平;中性粒细胞总数(Neu)、红细胞总数(RBC)和血红蛋白浓度(HGB)均较运输前显著上升(P<0.05),白细胞总数(WBC)有所上升但与运输前差异不显著(P>0.05),淋巴细胞总数(LYM)较运输前显著下降(P<0.05);血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、乳酸脱氢酶(LDH)、运输前后均未发生显著变化(P>0.05),谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、尿素(UREA)均较运输前显著上升(P<0.05);体重较运输前显著下降(P<0.05),运输后10d内体重已恢复至运输前水平。上述结果表明,长途运输可诱发驴的应激反应、肝脏损伤、机体代谢水平升高等,但免疫系统未受到明显损害,在落地后15d内机体逐渐从应激反应中恢复至运输前状态。     

采精年龄对德州驴精液品质的影响

以德州驴为试验动物,探究采精年龄对其精液品质的影响,旨在确定种公驴精液采集的最适年龄范围,从而最大限度地发挥优良种公驴的生产性能。对东阿国家黑毛驴繁育中心42头种公驴的采精状况进行整理,并将数据按年龄分为4组:4岁组(n=10)、5岁组(n=12)、6岁组(n=10)及7岁组(n=10)。结果表明:①采精年龄为6岁组时,其总精液量显著高于4岁组(P<0.05)和5岁组(P<0.05),但与7岁组间无显著差异(P>0.05);②采精年龄为4岁组时,其精液的精子密度与5岁组不存在显著差异(P>0.05),但均显著高于6岁组(P<0.05)和7岁组(P<0.05);③随着采精年龄的增大,各组精液的原精活力并无显著差异(P>0.05),但6岁组和7岁组的冻后活力却显著高于4岁组(P<0.05)和5岁组(P<0.05);④采精年龄为6岁组时,其精子的复苏率与7岁组不存在显著差异(P>0.05),但均显著高于其他各组(P<0.05);⑤采精年龄与总精液量、冻后活力、复苏率之间均呈极显著的正相关(P<0.01),与精子密度呈显著的负相关性(P<0.05)。结论:种公驴采精年龄为6～7岁时,可以获得较好的精液品质。     

重视驴寄生虫研究,促进养驴业健康发展

文章介绍了我国塔里木盆地的驴资源和驴用途,以及当前发展养驴业在新疆的重要意义。同时概述了我国驴的福利和健康问题,以及部分国内外对驴寄生虫的研究成果。建议应从流行病学调查为起始点,首先掌握塔里木盆地驴寄生虫的流行规律,为驴寄生虫病的科学防控提供依据。     

马驴养殖福利研究进展

动物福利是国内外学者热议的话题,也是标准化生产和畜产品质量安全的重要影响因素.动物福利体现在饲养、养殖环境、健康、行为等各个环节中.马驴作为中国重要的草食家畜,在精准扶贫和乡村振兴中发挥着重要作用.该文阐述了马驴养殖的经济价值,对中国马驴养殖福利现状和动物福利在马驴养殖中的相关影响因素进行探讨,为宣传、提升马驴养殖福利...     

驴辅助繁育技术研究进展

目前,驴产业正在由短期育肥向繁育兼顾的新型可持续发展模式转变,同其他畜禽品种类似,驴产业的转型也是以扩大优良种群和提高品种质量为前提基础,而数量的增加和质量的提高都离不开良种繁育这一关键环节。然而,母驴繁殖力低是制约驴产业成功转型的主要瓶颈之一。驴繁殖力低不仅导致现有驴群的扩繁速度慢,存栏量与日益增长的皮、肉、奶的消费需求之间差距越来越大,而且使新品种的培育周期延长。已有研究表明,辅助繁育技术在提高母驴繁殖性能和改良驴的遗传性状等方面发挥重要作用,如同期发情、排卵控制、人工授精和胚胎移植等辅助繁殖技术可大幅提高母驴的繁殖能力;同时,微卫星标记技术、线粒体DNA测序技术、单核苷酸多态性研究和全基因组选择技术等分子育种手段也能够进一步加快驴的遗传改良进程。文章简要介绍了驴的生殖生理,系统阐述了同期发情、排卵控制、人工授精、胚胎移植、分子标记辅助育种和全基因组选择等辅助繁育技术在驴上的研究进展,并对未来研究方向进行了展望,以期对提高母驴繁殖性能提供借鉴,为开展驴分子育种研究提供有效线索。