新疆野兔DNA条形码筛选

旨在筛选一种用于快速鉴定新疆兔属物种的DNA条形码。本研究以新疆4种野兔共计40例样本为研究对象,以CO1、ND4、16S rRNA和ITS2为候选基因,经PCR扩增和测序后,综合分析比较候选序列在种水平上的鉴定能力。结果表明,ITS2候选片段因未获得达到测序要求的PCR扩增产物最先被排除。相较于16S rRNA,CO1和ND4在序列特征、变异特征参数和秩和检验结果上均表现出更强的变异水平,遗传频率分布图有着更宽的gap,系统聚类树的鉴定结果有着更高的鉴定准确率。而从种间变异特征、种间秩和检验结果及遗传频率分布图来看,ND4均略优于CO1。本试验综合分析得到的最优DNA条形码为ND4,候补DNA条形码为CO1。该结论可为新疆兔属物种的分类分布研究和珍稀野兔资源的保护利用等提供一定的参考依据。     

基于线粒体基因的新疆三种野兔分类及遗传多样性

旨在利用分子遗传学方法探讨新疆3种野兔的系统发育关系和遗传多样性,以期明确其亲缘关系和分类地位,并评估其遗传多样性水平,为后续新疆野兔乃至中国野兔的保护遗传学等研究提供基础数据。本研究选用线粒体DNA的COI、ND4、16S rRNA 3个基因为分子标记,通过PCR扩增及测序技术分别测定采自新疆8个地区、4个地理组群共计57例野兔组织样本的3个基因序列,将序列校正拼接后用MEGA 7、DNAsp 6、Arlequin 3.1、MrBayes 3.2等软件进行数据分析。结果表明,将57例野兔样本的3个基因序列合并后共检测到43种单倍型,系统发育和中介网络图将相同及相邻地区的野兔划分为5个支系（Clade A-E）3大枝,且3大枝之间的遗传距离（4.21%~9.09%）均达到种间距离水平;其中,第3大枝中来自中部地区的野兔（Clade D）和新疆北部野兔（Clade E）的亲缘关系较近,二者之间的遗传距离≤2.26%,未达到种间遗传距离水平。新疆3种野兔中塔里木兔、藏兔帕米尔亚种和托氏兔西域亚种的单倍型多样性（h）较高,分别为0.979±0.014、0.972±0.064和0.972±0.064,而托氏兔西域亚种和中亚亚种的核苷酸多样性（π）较高,分别为0.033±0.018和0.023±0.015。基于线粒体3个基因的综合分析结果,结合已报道文献,本研究认为来自新疆西南部帕米尔高原的野兔应属于藏兔帕米尔亚种,支持将来自新疆北部阿勒泰及中部达坂城和托克逊地区的野兔分别划分为托氏兔西域亚种和托氏兔中亚亚种。新疆3种野兔具有丰富的遗传多样性和较明显的系统地理分布格局。     

鉴定气单胞菌DNA条形码的筛选与评价

为筛选合适的DNA条形码对气单胞菌属(Aeromonas)进行鉴定,以33株气单胞菌为材料,选取cpn60、recA和ppsA 3个候选DNA条形码进行PCR扩增及序列分析。以种间和种内遗传距离、序列扩增测序成功率、DNA条形码间隙(DNA barcoding gap)和系统发育树作为评价条形码片段的指标,筛选出该属的DNA条形码。分析表明,cpn60基因的扩增及测序的成功率最高,种内遗传平均距离(0.017)和种间遗传平均距离(0.133)差异显著,且存在较明显的DNA barcoding gap,表明cpn60可作为气单胞菌鉴定的DNA条形码。     

矩镰荚苜蓿与近缘种花苜蓿的DNA条形码筛选

为了筛选适于鉴定易混淆种矩镰荚苜蓿(Medicago archiducis-nicolai)和花苜蓿(M.ruthenica)的DNA条形码，本研究采集了两近缘种的113个样本，对6个候选条形码序列(通用序列rbcL,psbA-trnH,trnL-trnF,trnK-matK,ITS₂和新序列GA3ox1)进行PCR扩增、测序和序列比对，经过barcoding gap分析、wilcoxn检验以及构建NJ系统发育树评价各序列的鉴定能力。结果显示：6条候选序列的扩增和测序成功率在85%以上；rbcL序列在两近缘种间不存在变异位点，其余5条候选序列各有不同的种内变异和种间变异；5条候选序列的种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离，GA3ox1,ITS2和psbA-trnH序列在种内种间存在明显的“Barcoding Gap”区域；在候选序列构建的NJ系统进化树中，利用GA3ox1和psbA-trnH,矩镰荚苜蓿和花苜蓿均能各自形成单系，但trnL-trnF,trnK-matK和ITS2不能将两个近缘种区分开。通过分析，我们推荐使用核编码基因GA3ox1作为鉴定矩镰荚苜蓿...     

基于16S rRNA作为基因条形码对生鲜肉品物种检测方法的建立及应用

采用并合成了1对16S rRNA基因通用引物,通过PCR方法扩增了牛、羊、鸡、猪4种动物生鲜肌肉组织的16S rRNA基因,建立了PCR检测生鲜肌肉组织样品物种来源的检测方法。利用该方法,对采自青海西宁及海西州餐饮市场的30份所谓牛羊生鲜肉样品进行PCR检测,均扩增出约422 bp长度的DNA条带,纯化测序后进行序列分析,发现其中检测出11份鲜肉样品为赝品,实为斑嘴鸭(Anas Poecilorhyncha)肉。16S rRNA作为条形码基因对生鲜肉品物种的检测具有快速、特异、敏感、准确等优点,可以作为临床上检测生鲜肉品物种的方法进行市场检测。     

基于SRY基因鉴定新疆野兔性别

为得到形态上性别鉴定特征十分缺乏的新疆野兔样本的性别数据,本研究采用双重PCR法同时扩增SRY基因和APP基因,通过分析PCR产物,对采自新疆9个地区共121例未知性别的野兔样本进行性别鉴定。在验证PCR结果的可靠性后,鉴定出雌性样本69例,雄性样本52例,性别比例经统计学分析后接近1∶1,符合实际。这为后续研究新疆野兔的物种分类、群体遗传学和分子进化等方面提供了基础数据,也在兔类资源的管理保护和开发利用方面有着一定的实际意义。     

基于线粒体基因的新疆托氏兔遗传多样性和种群遗传结构评价

旨在利用线粒体基因测序方法评价新疆托氏兔的遗传多样性水平,并探究亚种间的遗传结构.本研究通过PCR扩增及测序技术,获得来自新疆北部、西北部以及中东部地区的共计78例新疆托氏兔线粒体DNA的CO1和D-LOOP基因序列,并采用生物信息学的方法进行数据分析.结果 表明,78个新疆托氏兔样本的合并序列共定义了68种单倍型,新...     

四种主要肉源动物肌肉组织16S rRNA基因的扩增及序列分析

为了研究牛、羊、鸡、猪四种主要肉类物种16S rRNA基因序列之间的差异及进化关系,进而为餐饮市场肉类的鉴定建立方法基础,试验合成了1对16S rRNA基因通用引物,通过PCR方法扩增了牛、羊、鸡、猪四种动物肌肉组织的16S rRNA基因并进行了序列和进化树分析。结果表明:所采用的PCR扩增体系和条件均能很好地扩增出四种动物的16S rRNA基因;与Gen Bank中各自对应物种的标准序列均具有99%以上的同源性,同源性较高;序列间富含174个位点的差异或插入缺失,同源性较低。在物种进化关系上牛、羊最近,其次是猪,最后是鸡。表明16S rRNA基因种属特异性显著,可以作为基因条形码的候选基因,可利用该基因建立相应的分子诊断方法,用于对肌肉组织进行物种的鉴定。     

不同地区褐黄血蜱的基因变异及遗传进化分析

为探究不同区域褐黄血蜱的基因变异情况及其遗传进化关系，试验以采集自湖南、河南省的20只褐黄血蜱为研究对象，通过PCR扩增其内转录间隔区Ⅱ（ITS-2）和烟酰胺脱氢酶亚基Ⅰ（nad1）基因序列，并对所获序列进行基因变异分析；在所获ITS-2和nad1基因序列的基础上，对不同地区褐黄血蜱的遗传进化关系进行分析，并利用ITS-2和nad1基因序列分别构建褐黄血蜱的系统进化树。结果显示，褐黄血蜱ITS-2基因序列长度均为1 160 bp，nad1基因序列长度均为285 bp；两省褐黄血蜱ITS-2及nad1基因的种内差异分别为0~1.9%和0~0.4%；湖南省褐黄血蜱的种内差异分别为0~1.4%和0~0.4%，而河南省的种内差异分别为0~1.2%和0~0.4%；两省褐黄血蜱ITS-2及nad1基因的种间差异分别为37.0%~52.0%和13.6%~24.8%。系统进化树结果显示，所有来自于两省的褐黄血蜱共处于同一分支上。结果表明，来自于两省的褐黄血蜱之间均存在基因变异的现象，但湖南省褐黄血蜱的基因变异程度和遗传多样性均高于河南省；两省褐黄血蜱之间的亲缘关系较近，暗示两省褐黄血蜱之间有基因交流，未出现遗传分化。     

四川省松潘县牦牛体表蜱、高原鼠兔携带巴尔通体和无形体的PCR检测与进化分析

旨在了解四川省松潘县牦牛体表蜱、高原鼠兔巴尔通体和无形体感染情况。采集牦牛体表的蜱和捕获高原鼠兔，对蜱进行形态学初步鉴定后，提取蜱和高原鼠兔脾总DNA，PCR扩增蜱16S rRNA、巴尔通体rpoB和无形体16S rRNA基因，对PCR产物阳性产物测序、比对及构建系统进化树，从而确定蜱种类及蜱和高原鼠兔感染巴尔通体和无形体的种类及感染率。结果显示：在松潘县进安乡、山巴乡、下八寨乡各采集到蜱102、97和131只，共计330只，经鉴定均为青海血蜱。蜱巴尔通体仅检出1种巴尔通体，与B.melophagi亲缘关系最近，进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为16.7%、8.2%和18.3%，其中下八寨乡检出率显著高于进安乡（P<0.05）；蜱源无形体进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为9.8%、12.4%和26.7%，下八寨乡检出率显著高于进安乡（P<0.01），检出的无形体均为1种，与牛无形体（A.bovis）亲缘关系最近；下八寨乡检出的鼠兔源巴尔通体与B.queenslandens亲缘关系最近，感染率为6.7%；进安乡、山巴乡和下八寨乡检出的鼠兔源巴尔通体与B.grahamii亲缘关系最近，感染率分别为8.7%、17.9%和13.3%，3个点检出率无显著差异；未定种Bartonella sp.（MN296294）和Bartonella sp.（MN296293）仅分别在进安乡和下巴乡检出；与蜱均检出无形体不同，高原鼠兔均未检出无形体。此外，蜱和高原鼠兔均未发现2种及2种以上病原混合感染。松潘县青海血蜱携带巴尔通体和无形体，高原鼠兔感染巴尔通体，且首次在高原鼠兔体内检测到疑似B.queenslandens的病原体，提示当地居民有感染这两类病原风险。     

Classification and Genetic Diversity of Three Hare Species in Xinjiang Based on Mitochondrial DNA

The study aimed to explore the phylogeny and genetic diversity of 3 hare species in Xinjiang by molecular genetics methods, define the relationship and taxonomy status, assess diversity level of Lepus in Xinjiang, and provide the basic data for conservation genetics of hares in Xinjiang and even in China. Three mitochondrial DNA genes, COI, ND4 and 16S rRNA, were used as molecular markers, and the sequences of 3 genes of 57 samples collected from 8 different regions (4 geographic groups) in Xinjiang were determined by PCR amplification and sequencing technology. After the sequences of COI, ND4 and 16S rRNA of each sample were revised and pooled together, data were analyzed with softwares such as MEGA 7, DNAsp 6, Arlequin 3.1 and MrBayes 3.2. A total of 43 haplotypes were detected from the combined sequences of 3 genes of 57 hare samples. Five distinct clades (A-E) and 3 clusters were clearly showed in phylogenetic tree and median-joining network (MJN). Furthermore, the genetic distance between 3 clusters reached the level of species (4.21%-9.09%). However, the genetic distance between hares from northern Xinjiang (Clade E) and those from central Xinjiang (Clade D) were not up to the level of species (≤2.26%) in the third cluster. The haplotype diversity (h) of Lepus yarkandensis, Lepus tibetanus pamirensis and Lepus tolai lehmanni were higher(0.979±0.014, 0.972±0.064 and 0.972±0.064, respectively), while the nucleotide diversity (π) of the L. t. lehmanni and L. t. centrasiaticus were higher (0.033±0.018 and 0.023±0.015, respectively). Based on comprehensive analysis of 3 genes of mitochondrion and reference with published research, it is suggested that hares from southwestern Pamir Plateau of Xinjiang should belong to L. t. pamirensis. Meanwhile,hares distributed in northern and central Xinjiang might be considered as L. t. lehmanni and L. t. centrasiaticus. Moreover, there is abundant genetic diversity in the 3 hare species in Xinjiang, and the obvious phylogeographic pattern is showed.     

石河子地区宠物犬蜱的种类鉴定及其携带布鲁氏菌的检测

为了解新疆石河子地区宠物犬体表寄生蜱的种类及蜱携带布鲁氏菌情况,本试验在形态学分类的基础上,基于线粒体基因12S rRNA和细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）对宠物犬体表采集寄生蜱进行分子生物学检测,使用DNAMAN软件比对分析序列同源性,并应用序列分析软件Mega 7.0邻接法构建蜱种系统发育进化树,分析蜱种的遗传进化关系;基于布鲁氏菌外膜蛋白Omp22基因对宠物犬体表寄生蜱进行布鲁氏菌PCR检测,确定宠物犬蜱布鲁氏菌携带情况。结果显示,宠物犬体表寄生的436只蜱的形态学与线粒体基因（12S rRNA和COⅠ）分子生物学鉴定结果一致,均为新疆优势蜱种之一——图兰扇头蜱（Rhipicephalus turanicus）。基于12S rRNA基因构建的蜱种系统发育树显示,本试验所得宠物犬体表寄生图兰扇头蜱序列与GenBank中已知图兰扇头蜱的序列聚为一大支。基于布鲁氏菌Omp22基因的巢式PCR扩增结果显示,宠物犬体表寄生图兰扇头蜱携带布鲁氏菌的阳性率为4.82%（21/436）,且同源性为100%。BLAST比对显示,本试验所得宠物犬图兰扇头蜱携带的布鲁氏菌与新疆流行株YC31（GenBank登录号：MK201679.1）、QH5（GenBank登录号：MK201678.1）、EM3（GenBank登录号：MK201677.1）和ML9（GenBank登录号：MK201676.1）的同源性均为100%。本研究通过形态学及分子生物学探讨了新疆石河子地区宠物犬体表寄生蜱的种类及携带布鲁氏菌基本情况,为宠物犬体表寄生蜱的种类及蜱传疾病的监测和控制等研究工作提供了基础资料。     

东帕米尔高原地区藏兔群体遗传进化分析

旨在利用分子遗传学方法检测东帕米尔高原地区极端环境对当地藏兔群体的遗传多样性、遗传结构及遗传分化的影响,为帕米尔高原物种多样性和遗传多样性的保护提供研究资料.本研究通过PCR扩增及测序技术测定东帕米尔高原地区藏兔的线粒体CO1与ND4基因序列,使用相关生物信息学软件进行数据分析.结果表明,东帕米尔高原地区4个采样点37...     

猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其部分毒力基因序列遗传变异分析

为了解吉林省猪伪狂犬病毒（PRV）的遗传变异情况,本研究将采集自吉林省疑似发生猪伪狂犬病的临床样品,通过细胞传代、PCR检测和测序分析进行病毒分离鉴定。TCID₅₀法测定分离毒株的病毒滴度,通过家兔感染试验测定分离毒株对家兔的致病性。对TK、gB、gC、gD和gE基因进行PCR扩增和测序,分析其遗传变异情况。结果表明,临床样品经PK15细胞传代后,有3份样品出现细胞病变,经PCR鉴定和测序分析表明,分离获得3株PRV,分别命名为PRV JL03、JL12和JL15株。通过PK15细胞测定分离毒株的病毒滴度分别为10^6.5、10^6.5和10^7.5TCID₅₀/mL。6只家兔分别接种3株分离毒株（10^3.5TCID₅₀/只）后均表现为体温升高、注射部位奇痒和四肢麻痹等症状,且于病毒接种后3~4 d全部死亡。3株分离病毒TK、gB、gC、gD和gE基因推导氨基酸序列分析结果表明,与参考毒株相比,分离株TK基因未发生氨基酸变异;gB、gC、gD和gE基因部分位点发生氨基酸缺失、插入或突变,其中gE基因在第48和496位分别存在1个天冬氨酸的插入,与国内报道的流行毒株变异特征一致。遗传进化树分析结果表明,3株分离毒株TK、gB、gC、gD和gE基因与国内2012年以后分离的参考毒株JS-2012和ZJ01等的上述基因均表现出较高的同源性,说明毒株间亲缘关系较近,位于同一分支;与国外分离毒株NIA3和Becker等亲缘关系较远,位于不同的分支;而与国内早期流行的毒株SC和Ea等亲缘关系介于二者之间。本研究成功分离鉴定了3株PRV变异株,分离毒株对家兔具有较强的致病性,该结果为吉林省PRV流行病学研究提供了新的数据,并为相关后续研究奠定基础。     

新疆黑蜂基因组选择信号分析

【目的】分析新疆黑蜂(Xinjiang Black bee)与4个引进西方蜜蜂品种间的遗传进化关系,并通过检测基因组选择信号,发掘新疆黑蜂重要种质特性相关的候选基因。【方法】对新疆黑蜂、意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)、高加索蜂(Apis mellifera caucasica)、卡尼鄂拉蜂(Apis mellifera carnica)、欧洲黑蜂(Apis mellifera mellifera)共5个蜂种50个蜂王个体和1个长白山中华蜜蜂蜂王(Apis cerana cerana)样本进行全基因组重测序数据分析,鉴定新疆黑蜂的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)标记,以长白山中华蜜蜂为外群利用邻接法构建系统进化树以阐明新疆黑蜂的进化关系,利用SNP信息进行新疆黑蜂的主成分分析、群体遗传结构分析及连锁不平衡分析;采用群体遗传分化指数(Fst)和核苷酸多样性比值(θπ)方法检测新疆黑蜂与其他西方蜜蜂群体间的选择信号,并对提取到的受选择区域候选基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】在新疆黑蜂中共鉴...     

The Isolation,Identification and Phylogenetic Analysis of Theileria

Bovine theileriosis was a kind of hemo-protozoan diseases that seriously hindered the sustainable development of cattle industry.In the present study, the infection of Theileria was detected using microscopic examination and species-specifc PCR of T.annulata, T.sergenti and T.sinensis from 18 blood samples collected from a breeding cattle farm in China.Then ITS and MPSP genes were amplified and cloned using universal primers of ITS and allele-specific primers of 4 major piroplasm surface protein (MPSP) from the positive samples.The sequences were used to make alignment, polymorphism and phylogeny analysis.The results showed that 3 samples were positive for Theileria and the 3 positive samples were all the T.sergenti infection.The amplification of allelic MPSP gene of T.sergenti from the 3 positive samples showed that two of them were single infection by Ikeda-type and another one was co-infection with both Chitose-type and Ikeda-type, while Buffeli-type and Thai-type were not detected.Moreover, on the basis of phylogenetic tree constructed with MPSP gene sequences, types 1 and 2 of MPSP were confirmed to be present in the cattle farm.The results revealed that there were T.sergenti infection in the breeding cattle farm, and these parasites at least with 2 allelic MPSP gene types were present, which indicated that the immune prevention and control of the disease became more complicated.Our research laid foundation of the further study on T.sergenti infection and disease prevention and control.     

牛泰勒虫的分离鉴定及进化分析

牛泰勒虫病是严重危害养牛业可持续发展的血液原虫病,本试验采用血涂片镜检和特异性PCR检测技术,对中国某种牛场的18份血样进行了泰勒虫检测,然后分别用ITS基因通用引物和4种MPSP等位基因特异性引物自阳性样品中扩增出对应的基因,克隆测序后,进行序列比对和进化分析,确定泰勒虫基因型。结果显示,自18份牛血样中检出3份阳性样品,且全为瑟氏泰勒虫感染;3个阳性样品的瑟氏泰勒虫MPSP等位基因扩增结果显示,1个阳性样品为I (Ikeda) 和C (Chitose)型的混合感染,另2个样品为I型单一感染,而均无B (Buffeli)和Thai型;用扩增的MPSP基因测序,构建进化树,确认其感染的瑟氏泰勒虫存在MPSP 1型和2型。这些结果表明,该种牛场存在瑟氏泰勒虫感染,且同时存在2种MPSP等位基因型;MPSP等位基因的复杂性可能使该病的免疫防控更加困难。本试验结果为深入研究瑟氏泰勒虫感染情况及免疫防控提供了数据支持,并为养防一体做好监控。