人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子(LYZop22)和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体(pGL3-LYZcw/op22/op)和人溶菌酶过表达载体(pcDNA-LYZcw/op22/op),将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞(BFFC)和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子(RSCU1.5)和7个低频密码子(RSCU0.5)对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子(LYZcw),翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍(P0.01)和1.30倍(P0.05);而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍(P0.01)和2.44倍(P0.01),说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍(P0.05)和1.5倍(P0.05),而LYZop则分别提高了22倍(P0.01)和17.8倍(P0.01),mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

烟粉虱溶菌酶基因的鉴定及表达分析

【目的】鉴定烟粉虱（Bemisia tabaci）体内的溶菌酶基因,并对其序列特征、进化关系和表达模式进行分析,探索该基因在烟粉虱应对球孢白僵菌侵染过程中的作用,为进一步解析烟粉虱先天免疫过程提供理论依据。【方法】以第2代高通量测序的结果为依据,比对非冗余核苷酸数据库,筛选E值＜10^-5的基因为烟粉虱溶菌酶基因（lysozyme gene of Bemisia tabaci,BtLyz）,利用ORF Finder预测BtLyz的开放阅读框,并得到氨基酸序列;利用Pfam和SMART预测BtLyz的蛋白质结构域;利用SinglP 4.1 Server预测BtLyz序列的信号肽;利用MEGA6.0软件进行BtLyz的氨基酸多序列比对;利用MEGA6.0软件,对BtLyz与其他昆虫的31个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用邻接法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析球孢白僵菌侵染烟粉虱卵、若虫、成虫后,在12、24、36、48、60 h时目标基因的时空表达模式。【结果】鉴定出烟粉虱4个溶菌酶基因,分别命名为BtLyz1、BtLyz2、BtLyz3和BtLyz4,基因序列全长分别为1 819、1 149、829和928 nt,分别编码159、160、148和160个氨基酸,且均含有信号肽。蛋白质结构分析、氨基酸序列比对和系统进化分析发现,BtLyz1和BtLyz4属于i型溶菌酶,BtLyz2和BtLyz3属于c型溶菌酶。BtLyz-1与豌豆长管蚜ApLyz-i1位于同一进化支上,BtLyz4与柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆长管蚜ApLyz-i2位于同一进化支上。BtLyz2和BtLyz3与褐飞虱NlLyz-c1和异色瓢虫HaLyz-c3位于同一进化支上。与对照相比,卵期4个溶菌酶基因和若虫期BtLyz4的相对表达量没有显著变化;若虫期BtLyz1的相对表达量先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,24 h时上调表达最明显,为对照组的4.55倍;成虫期BtLyz1和BtLyz4的相对表达量均为先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,60 h时上调表达最明显,为对照组的11.31和4.21倍;若虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调表达,在诱导24 h时上调表达最明显,为对照组的5.09和8.31倍,而后急剧下调,在60 h时下调表达最明显,为对照组的0.19和0.13倍;成虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调的表达趋势,在24 h时上调最明显,为对照组的5.56和8.84倍。【结论】从烟粉虱体内鉴定了4个溶菌酶基因序列,其中2个为c型溶菌酶序列,2个为i型溶菌酶序列;在球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态、不同时间后,卵期的相对表达量与对照相比没有显著变化;在若虫和成虫期,不同BtLyzs表现出不同的表达趋势。4个BtLyzs可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生物防治的潜在新靶标。     

miRNA-181b在牛腺垂体中的表达规律及其调控作用研究

[目的]探索m iRNA-181b在成熟（18月龄）和未成熟（1月龄）牛腺垂体中差异表达量及其调控功能。[方法]通过构建成熟（18月龄）和未成熟（1月龄）的延边黄牛腺垂体组织m iRNA cDNA文库,对文库中的m iRNA进行Solexa高通量深度测序,并对公牛腺垂体中的m iRNA进行鉴别。从测序结果中挑选出具有差异表达的m iRNA-181b,经实时荧光定量PCR验证其在不同发育期延边黄牛腺垂体中的表达规律,并通过TargetScanS预测m iRNA-181b的靶基因。[结果]m iRNA-181b在不同发育期牛腺垂体表达量存在显著差异,1月龄公牛腺垂体中m iRNA-181b表达量是18月龄的4.05倍。m iRNA-181b与FSHβ基因3＇非编码区838~844碱基可能是特异结合,其结合碱基为UGAAUGUA。[结论]该试验为FSHβ的转录后调控研究提供了理论依据。     

前列腺癌细胞系和组织中neprilysin的表达

目的检测neprilysin（NEP）在前列腺癌细胞系和组织中的表达。方法用实时荧光定量PCR、western blot检测前列腺癌细胞系（LNCaP、PC-3）、39例前列腺癌和16例正常前列腺组织中NEP mRNA和蛋白表达。结果与正常组织相比,LNCaP及PC-3细胞中NEP mRNA表达下调,尤以LNCaP细胞更为显著;在经甲基化抑制剂作用后,PC-3细胞NEP mRNA恢复表达的程度明显高于LNCaP细胞。前列腺癌组织中NEP mRNA和蛋白表达均明显低于正常前列腺。结论 NEP表达下调可能促进前列癌发生。     

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

miRNA-181b在牛腺垂体中的表达规律及其调控作用研究(英文)

[目的]探索miRNA-181b在成熟(18月龄)和未成熟(1月龄)牛腺垂体中差异表达量及其调控功能。[方法]通过构建成熟(18月龄)和未成熟(1月龄)的延边黄牛腺垂体组织miRNAcDNA文库,对文库中的miRNA进行Solexa高通量深度测序,并对公牛腺垂体中的miRNA进行鉴别。从测序结果中挑选出具有差异表达的miRNA-181b,经实时荧光定量PCR验证其在不同发育期延边黄牛腺垂体中的表达规律,并通过TargetScanS预测miRNA-181b的靶基因。[结果]miRNA-181b在不同发育期牛腺垂体表达量存在显著差异,1月龄公牛腺垂体中miRNA-181b表达量是18月龄的4.05倍。miRNA181b与FSHβ基因3 非编码区838 ~844碱基可能是特异结合,其结合碱基为UGAAUGUA。[结论]该研究为FSHβ的转录后调控研究提供了理论依据。     

牛妊娠相关糖蛋白6基因密码子优化及其在HEK293细胞中的表达

[目的]解决天然牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)不易分离纯化的问题,获得高效异源表达且具有良好免疫反应性的bPAG6,为国产bPAG检测产品的研发提供技术支持.[方法]根据宿主细胞对密码子的偏好性,利用MaxCodonTM在不改变氨基酸序列的前提下,对bPAG6基因密码子进行优化,采用全基因合成技术扩增优化后的bPAG6基因,构建proEM-bPAG6重组载体,并转染至HEK293细胞中进行高效表达;然后通过SDS-PAGE电泳、Western blotting和ELISA检测重组蛋白的表达效果及免疫反应性,并利用在线生物信息学分析软件对重组蛋白的结构及功能进行预测.[结果]优化后bPAG6基因的密码子适用指数(CAI)由0.80提高到0.96,G+C含量由49.4%提高到58.8%,其蛋白编码区(CDS)长度为1137 bp,共编码379个氨基酸残基.将全基因合成技术扩增获得的bPAG6基因插入proEM载体构建proEM-bPAG6重组载体,经EcoR I和Hind III双酶切鉴定可获得2条与预期结果相符的片段[proEM载体(4369 bp)和bPAG6基因(1176 bp)],测序结果也显示其碱基序列与优化后的bPAG6基因完全一致.proEM-bPAG6重组载体转染HEK293细胞表达获得的重组蛋白bPAG6分子量约46 kD.重组蛋白bPAG6可被抗bPAG6抗体识别,即具有良好的免疫反应性.重组蛋白bPAG6信号肽由N端的前15个氨基酸残基组成;存在5个N-糖基化位点,其N-糖基化修饰主要位于57Asn、73Asn、102Asn、124Asn和181Asn位点处;重组蛋白bPAG6为分泌性蛋白,无跨膜螺旋区,其二级结构由无规则卷曲(42.74%)、延伸链(31.93%)、α-螺旋(19.26%)和β-转角(6.07%)组成.[结论]通过基因优化及真核表达获得的重组蛋白bPAG6具有良好免疫反应性,可作为抗原应用于牛早期妊娠快速诊断产品的研发.     

LEPR基因在贵州白山羊组织中的表达

为探究瘦素受体基因(LEPR)在贵州白山羊组织中的表达规律,利用实时荧光定量PCR技术检测LEPR基因在贵州白山羊心、肝、脾、肺、肾、肠、背肌、腿肌和皮下脂肪9个组织的表达量。结果表明:目的基因LEPR和内参基因GAPDH的熔解曲线均呈单一峰形,说明所选条件可准确定量LEPR基因在贵州白山羊各组织中的相对表达量。具体表达量为脂肪脾肺背肌肠肝肾心腿肌。     

牛妊娠相关糖蛋白16(bPAG16)基因密码子优化及表达

[目的]对bPAG16基因进行优化和合成,构建proEM-bPAG16重组表达载体,将重组质粒转染至HEK293细胞中,获得bPAG16重组蛋白,为家畜早期妊娠诊断技术的研发提供技术支撑.[方法]通过生物学技术对bPAG16基因密码子进行优化和人工合成,经T4?DNA连接酶将bPAG16基因插入到proEM载体中,构建...     

人溶菌酶基因真核表达载体构建及其在牛乳腺上皮细胞中的表达

构建真核表达载体pEGFP-C1-hLYZ,并从基因水平研究人溶菌酶基因在体外培养的牛乳腺上皮细胞中的表达,为核移植提供转基因供体细胞.采用PCR的方法从人溶菌酶质粒中扩增854 bp人溶菌酶基因(包括完整的编码框446 bp).并克隆到pMD18-T载体上,用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切.将人溶菌酶基因的酶切片段(883 bp)定向克隆到pEGFP-C1的多克隆位点中,构建重组表达质粒pEGFP-hLYZ,并进行Hind Ⅲ和Bam HI双酶切鉴定.转染体外培养的牛乳腺上皮细胞,48 h后观察其表达情况.PCR检测溶菌酶基因的表达.成功构建了人溶菌酶真核表达载体,观察到表达绿色荧光蛋白的牛乳腺上皮细胞,并检测到溶菌酶基因.     

鸡β防御素1基因密码子优化及其在真核细胞中的表达

 鸡β防御素1在鸡防御系统中起重要作用,为实现其在真核细胞中的表达,本研究利用RT PCR从狼山鸡法氏囊中扩增出鸡β防御素1成熟肽基因,同时参照酵母密码子的偏好性,设计合成Gal 1成熟肽片段新基因,并在其3′端添加6×His序列以检测鸡β防御素1的表达情况,分别构建分泌型表达载体pPIC9K-Gal-1和pPIC9K-Gal-1-a-His,线性化后电转化导入毕赤酵母菌株GS115,G418抗性筛选高拷贝转化子,阳性克隆用甲醇诱导,Tricine SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定表达上清液。结果表明,从狼山鸡法氏囊中扩增出鸡β防御素1成熟肽基因,其序列与GenBank登录号AF033335的序列同源性为100%;Gal-1和Gal-1-a-His基因均成功整合到毕赤酵母基因组中,重组酵母蛋白Gal-1-His获得了成功表达。本研究为后续鸡β防御素1的高效表达和生物学活性研究奠定了基础。     

人类1号染色体可变剪接与普通剪接基因同义密码子的使用分析I.同义密码子偏爱使用分析

人类1号染色体可变剪接(选择性剪接)基因344非冗余蛋白质编码序列(188183密码子)和普通剪接(非可变剪接)基因的386蛋白质编码序列(223116密码子)被用于研究人类密码子使用偏爱模式.全部密码子使用数据分析表明,人类可变剪接基因密码子的偏爱水平显著高于普通剪接基因.在人类1号染色体基因中,密码子第三位置的G C含量有很大的异质性(0.24～0.95),并且可变剪接基因密码子第三位置平均G C含量(64.66%)大于普通剪接基因(59.97%).Nc值对GC3s图显示密码子偏爱使用除了受核苷酸组成制约外,其它的因子可能也影响密码子的使用变化.此外,可变剪接基因中以G 或C结尾的密码子比普通剪接基因出现的频率高.密码子使用的差异可能是由可变剪接基因pre-mRNA特有的结构特征和多种剪接模式决定的.     

利用密码子优化提高Bt cry1Ah基因在转基因玉米(Zea mays L.)中的表达

Bt cry1Ah基因是本实验室从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的一种新型杀虫蛋白基因。在前期工作中已根据植物密码子偏好性对cry1Ah基因进行过一次优化。根据玉米密码子偏好性对cry1Ah基因进行第二次优化,并将两次优化的cry1Ah基因分别构建了pAhmG和pmAhb植物表达载体,利用农杆菌介导法转化玉米自交系综31,分别得到10株和9株阳性转基因玉米植株。通过ELISA、Western blot检测及生物活性检测,比较不同优化的基因在玉米中的蛋白表达量及抗虫情况。初步结果表明外源基因在玉米植株中可以稳定表达并可以遗传。二次优化基因比一次优化基因在玉米中的蛋白表达量更高,抗虫性更好。表明密码子优化有利于提高外源基因的表达。     

溶菌酶基因合成及其原核表达

根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列,选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因,并在N-端加上23个氨基酸残基的α-淀粉酶信号肽序列和信号肽酶切位点HQP;用苷氨酸残基替代C-端的酰胺;新基因全长为576 bp,共编码190个氨基酸.为了检测该基因生物活性,将其克隆到原核表达载体pET28b( )中,导入宿主细菌E. coli BL21(DE3) pLysS,经IPTG诱导后,宿主细菌在2 h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解,说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性.     

人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达

将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组,在293细胞中包装重组腺病毒颗粒,获得真核细胞表达的栽体pAd-hLTF.以pcDNA3X为模板,PCR扩增hLTF基因,腺病毒穿梭栽体pshuttle-cmv与hLTF重组为pshuttle-cmv-hLTF:再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组为pAd-hLTF质粒:脂质体法将重组pAd-hLTF质粒转染HEK 293细胞.包装成重组腺病毒颗粒.Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达.结果表明,pAd-hLTT质粒转染293细胞后,7～10 d后,获得细胞裂解液,将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞,3～5 d后,80%以上的细胞变圆、膨胀、漂浮.Westem blot和ELISA结果显示,上清液中有hLTF基因的表达,为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础.     

13种哺乳动物OTR密码子使用偏性及其聚类分析

目的研究13种哺乳动物催产素受体基因（OTR）密码子使用偏性,并探讨其影响因素;通过对偏性情况进行聚类分析,研究其与系统发育的关系．方法计算RSCU,CBI,ENC等密码子偏性指标,与可能的几种影响因素做相关性分析,采用SPASS15．0软件,以相对同义密码子使用度为变量对偏性情况进行聚类分析．结果与结论1）CUG,GUG,GCC,UUC,AUC,CGC为哺乳动物OTR使用频率较高的密码子;2）密码子第3位碱基的GC含量是影响哺乳动物OTR密码子偏性的主要因素,基因的GC含量次之,而芳香族氨基酸的含量和蛋白疏水水平对其密码子使用偏性的影响不大;3）对于功能相同的基因,亲缘关系相近的物种密码子使用偏性指标较接近,但某些物种仍有一定差异．     

哺乳动物TRPM1密码子使用偏性及其聚类分析

瞬时受体势M亚基1(Transient receptor potential melastatin 1,TRPM1)是一种非选择性离子通道,主要通透Ca2+等二价金属阳离子。利用Codon W软件对15种哺乳动物TRPM1基因序列进行分析,比较了同义密码子相对使用度形成的聚类和编码区形成的系统发育树。结果表明,哺乳动物TRPM1基因对GCC、CAC、ATC、CTG、AAC、CCC、CAG、TCC、GTG和TAC密码子的使用存在偏好性,但终止密码子的使用不存在种属差异。密码子偏爱指数、有效密码子数、GC含量和密码子第三位的GC含量均能影响哺乳动物TRPM1基因所用密码子。两种聚类结果显示,由编码区形成的系统发育树能更准确反映物种间的亲缘关系。     

热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡及其对HSP70基因表达的影响

为探讨热应激对乳腺上皮细胞凋亡的影响,以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,取对数生长期的乳腺上皮细胞分别置于39℃和41℃热处理1 h(以37℃正常培养的细胞为对照),在37℃恢复培养0、6、12 h后收集细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,比色法分析Caspase-3活性,荧光定量PCR检测HSP70基因的表达水平。结果表明,39℃热应激组细胞生长抑制率和死亡率高峰期均发生在热修复6 h,细胞死亡率为15.42%,而41℃热应激组发生在热修复12 h,细胞死亡率高达23.18%;高温处理后,Caspase-3活性呈上升趋势;39℃热应激组在热恢复6 h,HSP70基因表达量显著高于对照组,41℃热应激组在热恢复0、6、12 h,HSP70基因的表达量分别为对照组的3.53倍、5.61倍和2.93倍。综上可知,高温应激激活了Caspase-3活性,从而诱导乳腺上皮细胞凋亡,并随高温强度的增加而作用增强,同时高温诱导了HSP70基因过表达,协助细胞获得热耐受性。     

Expression,Characterization and Antimicrobial Ability of a Variant T4 Lysozyme in Pichia pastoris

T4 lysozyme was engineered with disulfide bonds and expressed in Pichia pastoris. The secreted proteins were purified and made into powder by lyophiliza-tion. Recombinant protein purity was more than 70% measured by HPLC. The lytic activity of variant T4-lysozyme was measured by the lysis of the cel wal of Xan-thomonas oryzae pv. oryzae, X. oryzae pv. oryzicola, Ralstonia solanacearum comb. nov, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, X. campestris pv. mal-vacearum, Fusarium oxysporium sp. vasinfectum, Verticil ium dahliae kleb. Inhibition zone assay showed that variant T4 lysozyme significantly inhibited X. o. oryzicola and X. c. malvacearum. The antifungal activities of this protein against F. o. vasin-fectum and V. d. kleb were also analyzed.