猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase,PFKL)基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2 349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C_(3674)H_(5897)N_(1051)O_(1109)S_(40)。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

猪细小病毒疫苗株NS1基因克隆及生物信息学分析

为进一步开展猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）NS1蛋白功能研究,根据GenBank登录的PPV参考株NADL-2（登录号：NC001718）的NS1基因序列设计1对特异性引物,采用PCR技术扩增PPV疫苗株NS1基因,将PCR扩增产物克隆入pTA2载体构建重组质粒pTA2-NS1,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的pTA2-NS1质粒含有一个开放阅读框（ORF）,全长1989 bp,共编码662个氨基酸,与GenBank登录的PPV参考株NADL-2、Kresse株的NS1基因的核苷酸同源性分别为99.85%和99.65%,氨基酸同源性分别为99.70%和99.70%。上述结果表明试验成功构建了含有PPV NS1基因的重组质粒pTA2-NS1。应用DNAStar软件及在线ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM、Scansite、PSORTⅡ等生物信息学软件对NS1基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示NS1蛋白分子质量为75.7 ku,等电点PI为6.82,是弱酸性蛋白;NS1蛋白不含信号肽序列,无跨膜区,为可溶性蛋白,主要定位于细胞核内,T199、Y309、T338、T512、S631、T635为其潜在磷酸化位点。以上研究为进行PPV NS1蛋白表达,进一步开展NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

水牛SND1基因克隆及生物信息学分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛SND1（staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1）基因进行克隆和序列分析,为探究该基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛SND1基因（GenBank登录号：NM_205784.1）作为种子序列,利用Primer Premier 5.0设计3对引物,以水牛基因组DNA为模板,PCR扩增水牛SND1基因mRNA序列,扩增获得序列连接pMD18-T载体,通过测序拼接获得水牛SND1基因mRNA全序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,水牛SND1基因完整编码序列长为3 503 bp,包含长为2 733 bp CDS序列,编码910个氨基酸,蛋白分子式为C₄₅₂₃H₇₁₈₃N₁₂₈₁O₁₃₅₄S₂₆,分子质量为102.01 ku,理论等电点（pI）为6.74,不稳定系数为42.07,平均亲水性为-0.419,属可溶酸性蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占37.80%,无规则卷曲占34.18%。结合Protfun 2.2在线软件对SND1的功能进行预测分析表明,该蛋白在嘌呤和嘧啶、中央中间代谢、能量代谢、氨基酸生物合成发挥功能的可能性分别为0.449、0.401、0.303和0.262。SND1基因编码区序列与黄牛、绵羊、山羊、猪、马、人的同源性分别为98.7%、97.8%、97.8%、93.8%、93.1%和91.7%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。利用SMART在线软件预测蛋白结构域,结果显示,水牛SND1蛋白包含有4个SN区域,说明SND1基因编码区在进化过程中较为保守。     

水貂AANAT基因克隆及生物信息学分析

【目的】试验旨在对美洲水貂(Neovison vison)褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine, MT)合成的限速酶5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(aralkylamine N-acetyltransferase, AANAT)基因进行克隆和生物信息学分析,为探究AANAT基因在水貂中的生物学功能提供参考。【方法】对水貂尾静脉采血后提取DNA,利用同源重组的方法克隆AANAT基因并分析其编码区(CDS)序列,推导成氨基酸序列后进行相似性比对及系统进化树构建,并对AANAT蛋白进行生物信息学分析。【结果】水貂AANAT基因序列长约1 631 bp, CDS区长504 bp,可编码167个氨基酸。水貂AANAT氨基酸序列与雪貂相似性最高(98.2%),系统进化树分析也显示其与雪貂亲缘关系最近。生物信息学分析结果表明,水貂AANAT蛋白为疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,主要分布于细胞质中,有5个抗原结合位点为非分泌型蛋白,该蛋白含有多个磷酸化、糖基化等翻译后修饰位点。AANAT蛋白含有1个保守的N-酰基转移酶超家族结构域,该家族与哺乳动物的昼夜节律密切相关。AAN...     

美仁牦牛ILK基因克隆及生物信息学分析

为探究美仁牦牛ILK基因的结构与功能,利用PCR技术克隆了美仁牦牛背最长肌ILK基因CDS区序列,并利用在线软件预测和分析其编码氨基酸序列的生物信息学特征。结果表明,美仁牦牛ILK基因编码区长度1 359 bp,共编码452个氨基酸,是一种主要在细胞质中发挥生物学功能的亲水性蛋白;美仁牦牛ILK基因编码蛋白分子式C₂₂₇₆H₃₅₈₀N₆₅₆O₆₄₇S₃₀,分子量51 447.27 Da,原子总数7 189,理论等电点8.30,不稳定性指数41.47,共有27个磷酸化位点;同时,亚细胞定位结果表明,美仁牦牛ILK基因主要分布在细胞质中;系统进化树表明,美仁牦牛与野牦牛和普通牛亲缘关系最近,与非洲爪蟾亲缘关系最远。     

副猪嗜血杆菌sapA基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）sapA基因,并对其进行生物信息学分析,以期为sapA基因缺失疫苗的开发与应用提供理论依据。以71株临床菌株为研究对象,经PCR扩增鉴定其中的阳性菌株;将扩增得到的sapA基因片段与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸序列比对、系统进化树分析、蛋白二级和三级结构预测、疏水性预测、柔性区域位预测、B细胞抗原表位预测和Jameson-Wolf抗原指数预测。试验结果显示,在71株临床菌株中,有29株成功扩增出sapA基因,29株Hps的sapA基因核苷酸序列与已公布的SH0165菌株相似性为96.5%~98.8%,除H88菌株外,氨基酸序列与SH0165菌株相似性为98.9%~100%。sapA蛋白二级结构主要有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,有13个亲水区、38个柔性区和23个B细胞潜在抗原表位。以上结果表明,Hps的sapA基因是一个保守基因,各菌株间核苷酸序列、氨基酸序列都有很高的相似性,sapA蛋白具有较强的抗原性。     

牦牛CAPS基因克隆及生物信息学分析

钙磷蛋白(calcyphosine, CAPS)是一种钙结合蛋白,对维护生物体内钙磷平衡起着重要作用。本研究克隆了牦牛CAPS基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了生物信息学分析。结果表明,牦牛CAPS基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸;编码蛋白的分子式为C₉₀₅H₁₄₃₄N₂₆₆O₂₉₇S₈,分子量为21 049.43 Da,理论等电点为4.69,脂溶指数为75.29,不稳定指数为37.52,是疏水性稳定蛋白;系统进化分析表明,牦牛CAPS基因CDS区与普通牛和瘤牛的基本一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高。本研究为深入研究牦牛CAPS的生理功能提供了参考资料。     

猪SENP1基因克隆、生物信息学分析与表达研究

试验旨在对猪SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease 1,SENP1)基因CDS区进行克隆和生物信息学分析,并探讨SENP1基因在乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染PK15细胞后的表达情况。根据GenBank中公布的猪SENP1基因预测序列(登录号:XM_013997974.2)设计特异性引物,通过RT-PCR和T/A克隆技术对猪SENP1基因CDS区序列进行克隆测序,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR分析猪SENP1基因在JEV感染PK15细胞不同时间点(0、12、24、36、48 h)的表达情况。结果显示,猪SENP1基因CDS序列全长2 034 bp,共编码677个氨基酸。序列比对和系统进化树分析结果表明,猪SENP1蛋白序列和山羊、犬、人、牛的相似性分别为94.8%、94.2%、93.9%和93.8%,说明在这些物种中SENP1的保守性较强;猪与犬的SENP1分子亲缘关系较近。生物信息学分析结果显示,猪SENP1蛋白相对分子质量为76 825.76,等电点为8.53,体外半衰期为30 h,不稳定系数为53.59,总平均亲水指数为－0.622。SENP1蛋白不含信号肽序列,无跨膜结构域。二级结构分析结果显示,SENP1蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占31.31%、46.68%、16.25%和5.76%。三级结构分析结果显示,猪SENP1蛋白中存在8个α-螺旋区和7个β-转角区。实时荧光定量PCR结果显示,猪SENP1基因在JEV感染的PK15细胞中呈现上调表达趋势,其中在感染后48 h SENP1基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。本试验结果为后续深入研究SENP1基因功能提供了参考。     

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP78）基因,并进行生物信息学分析,探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列（登录号：XM_001927795.6）设计引物,PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列,使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构,并进行同源性比对及系统进化树构建,利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示,猪GRP78基因CDS区长1 965 bp,可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明,GRP78理论分子质量为72.3 ku,等电点（pI）为5.06,半衰期为30 h,其水溶液在280 nm处的消光系数为30 495,肽链N端为蛋氨酸（Met）,不稳定系数为32.39,属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40,总平均疏水指数为-0.496,无跨膜结构,存在信号肽序列,说明该蛋白属于分泌型蛋白;GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域：HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示,GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示,猪GRP78基因与人（登录号：NM_005347.4）、小鼠（登录号：NM_001163434.1）、大鼠（登录号：NM_013083.2）、山羊（登录号：XM_005687138.3）、牛（登录号：NM_001075148.1）核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%,氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%,各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达,在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。     

牦牛死亡结构域蛋白(FADD)基因克隆与生物信息学分析

死亡结构域蛋白(FADD)是在生物细胞里起到信号转导作用的一种蛋白,在胚胎发育、细胞凋亡过程中发挥重要的生物学活性。实验以成年母牦牛的卵巢RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆牦牛FADD基因,并进行了生物信息学分析。结果表明:牦牛FADD基因CDS区长度630 bp,编码209个氨基酸,蛋白分子式C996H1632N300O307S7,整个蛋白质带负电荷,总共原子数量3 242;分子质量23.0 ku,半衰期30 h;理论等电点6.11;消光系数18 240;不稳定指数49.08,属于不稳定蛋白;脂肪系数104.64,平均亲水系数-0.168,预测FADD蛋白为亲水蛋白。系统进化树表明,牦牛与哺乳动物亲缘关系近,与鱼亲缘关系最远,符合物种进化规律。FADD蛋白质的二级结构α螺旋、自由卷曲、β-转角和延伸链,占靶蛋白的比例分别为71.29%、22.97%、3.83%和1.91%,与三级结构相符。牦牛FADD蛋白有13.0%位于细胞核、52.2%位于细胞质、8.7%位于细胞外、13.0%位于线粒体、4.3%位于高尔基体和8.7%位于细胞骨架。该研究成功克隆出牦牛FADD基因CDS区,为进一步研究其功能提供了一定理论依据。     

水貂PRLR基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在从水貂卵巢组织中克隆催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因编码区全长序列,并进行生物学信息分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据GenBank中登录的犬PRLR基因的mRNA预测序列(登录号:XM_025436332.1)设计1对引物,采集性成熟的健康水貂卵巢组织样本,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增PRLR基因,将其插入pEASY-Blunt Simple Vector中,筛选阳性克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示,水貂PRLR基因编码区序列全长为1 878bp,编码了625个氨基酸,水貂PRLR基因核苷酸序列与海獭同源性最高,为97.7%。系统进化树分析也显示其和海獭亲缘关系最近。对水貂卵巢PRLR基因编码蛋白进行生物信息学分析表明,PRLR蛋白含有1个信号肽,1个细胞外区域,1个跨膜区和1个膜内区;水貂PRLR蛋白为单次跨膜蛋白,其N端的D1部分含有2对保守的二硫键(Cys36—Cys46和Cys75—Cys86),D2部分含有保守的WS-基序(WS-E-WS)。水貂PRLR蛋白具有和其他PRLR蛋白相似的膜外和膜内结构。本试验结果为进一步研究和揭示水貂PRLR蛋白的结构及功能奠定了基础。     

牛源IL-6基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆牛白细胞介素-6（IL-6）基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析,对荷斯坦奶牛进行尾根采血提取RNA后逆转录为cDNA,根据NCBI数据库中已知的牛IL-6基因mRNA序列设计特异性引物,应用RT-PCR技术克隆得到CDS区全长序列,利用生物信息学软件分析牛IL-6基因序列特征、同源性及编码产物的理化性质等。结果表明,试验成功克隆了牛IL-6基因CDS区,全长627 bp,分子质量为23.759 ku,共编码208个氨基酸,理论等电点为7.58,脂溶系数为93.37,属于亲水性蛋白;牛IL-6基因与猪、绵羊、大鼠、人、猫、犬、鸡、小鼠、马和兔的同源性分别为84.4%、96.2%、66.7%、77.5%、75.9%、79.3%、48.5%、67.0%、79.5%和67.5%;系统进化树分析发现,牛与绵羊亲缘关系最近,猪次之,鸡最远;在二级结构预测中,该蛋白无规则卷曲与α-螺旋分别为34.6%和60.1%;亚细胞定位于细胞质;该蛋白含有信号肽和跨膜螺旋结构。本研究为进一步分析牛IL-6基因的功能奠定了一定的理论基础。     

民猪FoxN1基因的克隆及生物信息学分析

试验旨在对民猪FoxN1基因的结构和功能进行初步探索。利用常规PCR技术对民猪FoxN1基因进行克隆,利用生物信息学手段对所获得FoxN1基因完整编码区序列进行分析,对民猪和大白猪的FoxN1基因序列进行比对,并构建分子进化树。结果显示,民猪FoxN1基因完整编码区长1 941 bp,编码646个氨基酸,分子质量为68.64 ku,理论等电点为5.81。FoxN1蛋白位于细胞核内,不存在信号肽,不是分泌性蛋白,不存在跨膜区,在第269-347氨基酸处有1个叉头结构域,该蛋白在不同的物种间有高度的保守性。克隆发现了3种转录剪切变异体,与变异体1相比,变异体2在第124-387核苷酸位置处发生缺失,变异体3在581-582处发生GCA插入。民猪与大白猪的FoxN1基因序列相比,存在4个突变位点,其中3个是同义突变,1个是错义突变,导致第108位的氨基酸发生了改变。由分子进化树得知,民猪与偶蹄目动物亲缘关系较近。上述结果表明FoxN1基因结构复杂,对其生物信息特性的探究将为进一步揭示民猪FoxN1基因的功能提供依据。