牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】同期发情处理后,经B超声波连续监测(每12h一次)采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles, SF);其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞(granulosa cells, GCs),抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高(99.4%),与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs)的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF(P0.01),且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F_2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。     

马铃薯低温响应的ScmiR390-5p及其靶基因表达与结构分析

【目的】研究马铃薯富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase LRR-RLK)类受体蛋白激酶基因SCLRRK1受miR390（ScmiR390-5p）调控响应非生物胁迫的机理。【方法】通过低温响应马铃薯miRNA测序分析与靶基因预测,发现ScmiR390-5p通过调控1个可能的LRR类受体蛋白激酶基因对低温做出响应;利用实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR）验证ScmiR390-5p和SCLRRK1响应低温胁迫的表达情况;利用RLM-5′RACE确定ScmiR390-5p作用于SCLRRK1的切割位点;利用PCR技术克隆得到SCLRRK1的DNA序列和CDS序列,生物信息学分析SCLRRK1的结构和功能;利用RT-qPCR分析ScmiR390-5p/SCLRRK1在马铃薯各组织中的表达情况及其响应各种非生物胁迫的表达情况。【结果】RT-qPCR结果表明,低温诱导ScmiR390-5p表达,SCLRRK1的表达则受到低温的抑制,ScmiR390-5p和SCLRRK1的表达在低温胁迫下呈负相关性;RLM-5′RACE分析表明,ScmiR390-5p作用于SCLRRK1的切割位点是ATTCCT//CCTGAGTT,马铃薯ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在低温响应中起作用。克隆结果表明SCLRRK1的CDS序列长度为2 685 bp,编码894个氨基酸,DNA序列长度为3 549 bp,含有1个内含子、2个外显子、3′非编码区和5′非编码区,ScmiR390-5p的靶位点位于SCLRRK1 CDS序列内部（960—981 bp,GGAACTATTCCTCCTGAGTTT）。生物信息学显示SCLRRK1是1个富含亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)的类受体蛋白激酶基因,编码的蛋白属于跨膜分泌蛋白。马铃薯组织表达RT-qPCR分析显示,ScmiR390-5p在叶中的表达量最高,根次之,茎中（地上茎、块茎和匍匐茎）表达量较低;而SCLRRK1的表达情况与ScmiR390-5p相反,其在叶中的表达最低,在茎中表达最高（匍匐茎>块茎>地上茎）。多种非生物胁迫结果显示,ScmiR390-5p和SCLRRK1表达在NaCl胁迫下呈负相关,ScmiR390-5p受到NaCl胁迫诱导表达。与对照相比,ABA和6-BA处理下ScmiR390-5p表达先下降之后呈波浪小幅回调;6-BA处理下SCLRRK1表达持续升高,ABA处理下SCLRRK1表达先上升后下降。GA₃、PEG和IAA处理8 h时,ScmiR390-5p的表达达到峰值,GA₃、PEG和IAA处理都能诱导SCLRRK1表达,但其变化趋势与ScmiR390-5p相关性不强。【结论】SCLRRK1具备编码LRR类受体蛋白激酶的核酸、氨基酸序列和结构基础,是ScmiR390-5p的靶基因;ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在马铃薯组织器官中具备明显作用;ScmiR390-5p在转录后水平通过抑制马铃薯SCLRRK1的表达对低温胁迫做出响应,同时,马铃薯ScmiR390-5p/SCLRRK1调控模块在NaCl和6-BA胁迫响应中起作用,但不对ABA、GA₃、IAA和PEG胁迫做出响应,ScmiR390-5p和SCLRRK1分别在转录水平受到ABA、GA₃、IAA和PEG胁迫信号调控。     

苏博美利奴羊胚胎期WNT2基因的组织表达及其生物信息学预测分析

【目的】检测WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135 d不同组织中的表达水平,了解WNT2基因的分子结构和进化特征,从分子水平及进化特征上研究苏博美利奴羊的组织器官与WNT2基因表达之间的内在联系,为筛选细毛羊毛囊发育相关候选基因提供理论依据。【方法】采用qRT-PCR法研究苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达,并使用PROMO软件预测WNT2基因启动子区域序列的转录因子,并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化,使用MEGA 7.0软件分析WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分及密码子的偏好性,并且利用绵羊、山羊、牛、人等9个物种的WNT2基因的DNA序列构建系统进化树。【结果】WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织。在绵羊WNT2基因启动子区域序列共预测出101个相关转录因子,4种碱基呈现均匀分布,CAG与UCU是使用相对较多的密码子,对WNT2基因的DNA序列系统进化树分析发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他哺乳动物进行比较时更为接近。【结论】建立了胚胎期135 d的苏博美利奴羊的不同组织中WNT2基因表达量的RT-PCR方法,并使用生物信息学软件对其分子结构和进化特征进行分析。     

牛卵泡颗粒细胞CART与候选受体的分子对接及其功能

通过同源建模预测牛卵泡颗粒细胞(GCs)可卡因–苯丙胺转录肽(CART)与候选受体ZMPSTE24的三维结构,运用分子对接技术分析二者的结合模式,探究其分子互作关系;选取3头健康成年母牛,分离GCs,转染TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默序列,提取总RNA,并采用q RT–PCR检测TEDDM1、AGTR2、CMKLR1、ZMPSTE24等4个候选受体沉默后m RNA的相对表达量;采用CCK–8法测定各试验组和对照组GCs增殖情况;采用ELISA法检测各组培养液中雌激素(E2)的质量浓度,研究此4个候选受体在牛卵泡GCs中的功能。结果表明：ZMPSTE24与CART存在1个结合位点、9个盐桥、17个氢键;4个候选受体试验组的m RNA相对表达量均极显著(P<0.01)低于si NC组和空白组的,表明TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24在GCs中沉默效果良好;TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默后,各试验组的细胞增殖率和培养液中E2质量浓度均极显著(P<0.01)低于阳性对照组(不加CART)的。可见,4个...     

小麦叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)基因的克隆与表达分析

【目的】研究弱光环境下叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)的表达水平变化,分析叶绿素合成途径对于弱光环境的响应。【方法】利用同源克隆,由小麦品种新冬20号克隆TaCAO并分析其序列。使用半定量PCR方法分析900、1 800、3 600和7 200 lx光照强度下TaCAO表达量。【结果】该基因ORF长度为1 653 bp,编码蛋白大小为62.12 kD,包含550个氨基酸残基,含有叶绿素转运肽和Rieske_RO_Alpha_CAO结构域,还存在一个Rieske铁硫配位中心和铁结合位点,随着光照强度的减弱,TaCAO表达量呈现上升的趋势。【结论】克隆获得的TaCAO长度为1 653 bp,具有完整的CAO活性,TaCAO的相对表达量与光照强度呈反比关系。     

棉铃虫中肠特异性结合蛋白ABCC1对Cry1Ac毒力的影响

【目的】 研究棉铃虫（Helicoverpa armigera）中肠蛋白ABCC1（HaABCC1）与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】 分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系（96S）和Cry1Ac抗性品系（BtR）棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】 HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系（BtR）与敏感品系（96S）棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】 HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

基于DNA条形码基因快速鉴定帕米尔高原南麓部分地区农田叶蝉

【目的】 研究更加便捷高效的鉴定技术,提高叶蝉鉴定的速率,为帕米尔高原南麓部分地区叶蝉的鉴定及防治提供基础数据。【方法】 利用DNA条形码技术,选择mtDNA COI、Cytb、ITS2基因,运用通用引物PCR扩增并直接测序,借助生物信息学分析软件对比分析目的基因序列的相似性,构建系统进化树,分析遗传进化关系,获取叶蝉DNA条形码。【结果】 获得了19条mtDNACO1、Cytb及ITS2基因序列,COI基因6条、Cytb基因7条、ITS2基因6条,可作为叶蝉的DNA条形码,包括其中1条COI新序列,5条Cytb和6条ITS2序列。【结论】 获得19条叶蝉的DNA条形码,实现了帕米尔高原南麓部分地区农田4种叶蝉的快速准确鉴定。     

转录组测序筛选牛卵泡发育相关基因及其表达差异分析

【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second largest follicle at predeviation,PDF2),构建RNA文库后Illumina平台测序,经数据库比对,设定参数筛选高表达基因、差异表达基因并进行GO分析,Genecards基因功能查询进一步筛选与卵泡发育直接相关的调控基因,q RT-PCR对筛选的基因进行表达量验证分析。【结果】两个转录本中共获得263个差异表达基因;GO功能聚类分析共分为三大类90组:其中生物学过程占64.4%,细胞组分占17.8%,分子功能占17.8%;获得一些重要的功能富集通路,如调控信号转导和细胞因子应答的生物途径;基因表达量分析筛选出10个高表达的上调和下调基因,获得参与雌激素合成和胎儿性别发育的CYP17A1、参与类固醇激素合成的LOC785462、细胞发育过程中调节细胞凋亡的DACH1以及调节ERK和MEK1/2信号通路的MAP3K3。Genecards功能查询共获得6个基因与卵泡发育关系较为密切,其中上调基因分别为PRSS35,PTGRF,ARID4B,GPR116;下调基因为APOA1和CPXM1;q RT-PCR结果显示,PRSS35和ARID4B在DF中的表达量显著高于SF(P0.05),CPXM1在SF中的表达量极显著高于DF(P0.01),PTGRF,GPR116和APOA1在DF和SF中的表达量不存在显著差异(P0.05),但其表达变化趋势与高通量测序结果相一致。【结论】转录组测序结果真实可靠,PRSS35和ARID4B在卵泡发育过程中发挥正调控作用,CPXM1在卵泡发育过程中发挥负调控作用,获得的牛卵泡发育相关基因和重要调节途径,对后期深入探讨卵泡发育调控机理的研究具有重要意义。     

LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

鸭维甲酸诱导基因I克隆及其结构域功能分析

【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）,分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS（coding sequence）区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体（RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C）,转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达变化。【结果】鸭RIG-I基因CDS区全长2 802 bp,共编码933个氨基酸;不同结构域缺失突变体的真核表载体转染DF1细胞后,重组蛋白均在DF1细胞中表达;RT-qPCR结果显示,N端能显著激活RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达上调。【结论】 duRIG-I及不同区段均能在DF1细胞中表达,其中N端在调节RLR抗病毒信号通路下游基因的表达过程中发挥了重要作用。     

二花脸猪linc-NORFA核心启动子鉴定与转录调控分析

【目的】 前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】 采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】 通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988 — -684 bp（转录起始位点作为+1）,生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性（P<0.01）,同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达（P<0.01）。【结论】 鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。     

紫花苜蓿MsMAX2的克隆及功能研究

【背景】分枝是重要的产量构成因子,在紫花苜蓿育种中至关重要。发掘紫花苜蓿分枝相关基因并明确其作用机理,有助于加快紫花苜蓿高产优质育种。MAX2是重要的分枝相关基因,参与多种植物的分枝调控。【目的】通过对紫花苜蓿MsMAX2功能的研究,为建立MsMAX2调控紫花苜蓿分枝发育分子机制奠定基础。【方法】利用同源克隆的方法从紫花苜蓿中获得MsMAX2的基因序列。通过Expy Protparatam、DNAMAN和MEGA-X等软件对MsMAX2进行序列分析并构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析MsMAX2在紫花苜蓿中的组织表达特异性。运用烟草瞬时表达系统确定MsMAX2蛋白的亚细胞定位。利用农杆菌介导的转化方法获得转基因拟南芥,以明确MsMAX2的基因功能。用酵母双杂交技术探明与MsMAX2互作的蛋白。【结果】MsMAX2包含长度为2 136 bp的开放阅读框,编码由711个氨基酸构成的蛋白,属于F-box蛋白超家族。系统进化分析表明,MsMAX2及其同源基因的进化与物种的分化高度相似,表明其是一个功能保守的基因。MsMAX2在紫花苜蓿的颈部组织中表达量最高,苗期叶片和授...