广西地区猪肠病毒G型的流行病学调查及VP1基因序列分析

为分析广西地区猪肠病毒G型(EV-G)的流行状况及分子遗传演化特征,本研究收集2017-2018年广西地区222份临床腹泻样品,进行EV-G的检测、流行病学调查及VP1基因的扩增、克隆和序列分析。流行病学调查结果显示,广西地区2017-2018年EV-G的样品阳性率为6.76%(15/222),而猪场阳性率则高达16.98%(9/53)。值得注意的是,广西地区2017-2018年EV-G的样品阳性率从2017年的4.55%上升至2018年的10.00%,上升幅度较大。同时发现该病毒在冬春季节的检出率较高。序列同源性分析结果显示,本研究获得的2株EV-G VP1基因之间的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸同源性为98.8%,与国内外毒株VP1基因的核苷酸同源性为62.4%～80.1%,氨基酸同源性为45.7%～71.7%。遗传进化分析显示,本研究获得的2株EV-G VP1序列在同一分支,均属于G1亚型,与美国分离株13-03212遗传关系密切。氨基酸序列比较结果显示,广西地区该2株EV-G VP1氨基酸在多个位点发生了变异。抗原指数分析显示,广西地区EV-G型流行毒株的抗原性变化较大。表明2017-2018年广西地区存在一定程度的EV-G感染,本研究结果为明确EV-G型的流行概况及EV-G型的分子特性提供了参考依据。     

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678 bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。     

吉林地区1株小鹅瘟病毒NS1和VP1基因的克隆与序列分析

为了解吉林地区小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的基因特征,及其与黑龙江及中国其他省份和国外流行毒株的相关性,本研究采用PCR方法鉴定2018年吉林某养鹅场送检的病死雏鹅的肠组织,同时对GPV的非结构蛋白NS1基因及结构蛋白VP1基因进行了克隆和测序,并与国内外16株GPV参考毒株的相应序列进行分析。结果表明,病死雏鹅为GPV与减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）混合感染;吉林地区GPV的NS1基因长为1 884 bp,编码627个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.8%~99.8%,氨基酸序列同源性为97.1%~99.7%;VP1基因长为2 199 bp,编码732个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.4%~99.9%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.9%。NS1及VP1基因的系统进化树分析均表明,吉林地区GPV与哈尔滨分离株98E属于同一进化分支,亲缘关系最近,与国外分离株、中国台湾和安徽分离株亲缘关系均较远。吉林地区GPV与鹅源GPV具有较近的亲源关系,同源性明显高于其他水禽来源的GPV。该研究为明确中国东北地区GPV空间的流行规律提供基础数据,为东北地区GPV的诊断与治疗提供参考依据。     

2017年江西部分地区PEDV分子流行病学调查

为了解江西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2017年采自江西省部分地区规模化猪场182份腹泻仔猪小肠组织和粪便样品进行检测,并设计了2对引物对37份阳性病料的S基因进行扩增、克隆及序列测定,以及与GenBank中登录的22株PEDV S基因参考序列进行遗传进化分析。结果显示,37株PEDV江西流行株的S基因序列长为4 158或4 161 bp,编码1 385或1 386个氨基酸,全部为Group 1型,与美国流行毒株较为接近,而与欧洲毒株(Br1/87)及疫苗株(CV777)亲缘关系较远;37株PEDV中有36株为G1-1亚群,1株为G1-2亚群;37株PEDV江西毒株间的S基因核苷酸序列同源性为96.9%～100.0%,氨基酸序列同源性为96.1%～100.0%,与22株参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为92.7%～100.0%和91.5%～100.0%;相较于CV777疫苗株,PEDV江西流行毒株的S基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了2017年江西部分地区PEDV的流行与变异情况,为指导江西省PEDV的科学防控提供了参考依据。     

猪萨佩罗病毒HNHB-01株 VP1基因的表达与分子特征

猪萨佩罗病毒(PSV)VP1蛋白是位于病毒粒子表面的结构蛋白,发挥主要的抗原效应。为了弄清PSV HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征,本研究设计针对VP1基因的特异性引物,通过RT-PCR扩增获得VP1基因,并重组到真核表达载体pCAGGS上,经Western blot、间接免疫荧光鉴定,成功表达VP1蛋白。随后基于PSV HNHB-01株全基因序列以及VP1基因序列与其他参考毒株的基因序列构建遗传进化树,分析遗传进化关系。结果表明：实验室分离的HNHB-01株与2017年分离的HNXX-01株亲缘关系最近,与日本株JPSV-1315关系接近;HNHB-01 VP1基因与国内2016-2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源,与国外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因亲缘关系较近;HNHB-01株VP1氨基酸与HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高,同源性为99.32%。三级结构分析表明,VP1蛋白存在3条位于蛋白结构外侧的抗原表位区,对应的氨基酸序列分别为20～30 aa、90～100 aa和265～275 aa。本...     

2016—2018年广西猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查和PRRSV ORF5基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行和变异情况,试验应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法对2016—2018年广西14个地区规模化猪场的1 564份主要脏器进行了PRRSV检测,选取部分阳性样品进行ORF5基因的扩增并进行序列分析。结果表明:共检测出PRRSV阳性样品467份,阳性率为29.9%。在广西14个地区规模化猪场送检的样品中均能检测到PRRSV。从年份上看,2016年的PRRSV阳性率最高,为43.9%;2017年为26.9%;2018年最低,为23.7%。获得的25条PRRSV ORF5基因序列中有1株与NADC30株同源性较高,1株与GM2株同源性较高,其余23株均与高致病性PRRSV同源性较高。在25株PRRSV中有21株与TJM、JXA1、HuN等高致病毒株亲缘关系较近,并位于同1个分支;2株处于经典株和变异株之间,分别形成2个分支;1株与NADC30株亲缘关系较近,位于同1个分支;1株与GM2株亲缘关系较近,位于同1个分支。PRRSV ORF5基因编码氨基酸序列分析结果表明,25个毒株均为毒力较强的野毒株。说明广西地区仍以高致病性PRRSV为主要流行毒株,但2018年新发现类NADC30毒株和类GM2毒株的流行。     

广西地区犬细小病毒检测及VP2基因序列分析

为了调查广西地区犬细小病毒(CPV)的优势毒株及其遗传变异情况,试验利用PCR方法对采自广西地区的423份犬血清样本进行CPV检测并扩增其VP2基因,利用MegAlign软件进行同源性比对并分析VP2蛋白主要突变的氨基酸位点,同时利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建遗传进化树。结果表明：共获得55份CPV阳性血清样本,阳性率约为13.0%。PCR扩增得到大小约为1 755 bp的VP2基因。55株分离毒株之间的相似性为98.6%～100%;分离毒株与国内外参考毒株的相似性为97.4%～100%,与疫苗株Pfizer/vaccine/06的相似性为98.3%～98.9%。扩增序列的推导氨基酸主要在第5,297,370,426,440位发生变异。在55株分离毒株中,有32株为New CPV-2a亚型毒株,20株为CPV-2c亚型毒株,3株为New CPV-2b亚型毒株。55株分离毒株形成3个主要的流行分支,与国内参考毒株的亲缘关系较近,而与国外参考毒株、猫细小病毒的亲缘关系较远。说明New CPV-2a、CPV-2c、New CPV-2b亚型毒株在广西地区流行广泛,正逐步取代CPV-2a...     

广西地区猪伪狂犬病病毒gE基因的序列分析

探讨广西地区近期流行猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的变异规律,以及与国内外毒株的基因差异性,为制定有效的猪伪狂犬病防控措施提供科学依据。对广西不同地区流行的PRV gE基因进行克隆和序列测定,并与国内外PRV毒株的gE基因进行同源性比对分析,构建遗传进化树。广西地区流行的PRV与广东Fa株、湖北HD株的gE基因核苷酸的同源性与编码氨基酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.7%;广西地区流行毒株间gE基因同源性达99.5%~99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.8%~99.7%,广西地区近期流行PRV毒株的变异不明显。4株PRV毒株与近年国内分离的毒株ZK、NY、QBA、HNXX、MZ1处于同一分支上,遗传关系较近;而与国内经典株Ea、GDSH遗传关系稍远,与国外分离株Yangsan、NiA3、Becker、Rice处于不同的遗传分支,保持较远的亲缘关系。4株PRV gE基因的48位点氨基酸和其中的GXNN1、GXBH1的496位点氨基酸增加1个天冬氨酸的插入,具有变异株的特征。广西地区流行的PRV毒株属于目前我国主要流行的变异株,其氨基酸的插入将对变异株的分子流行病学调查提供重要的参考。     

2013~2018年江西省猪伪狂犬病病毒流行株gE和gB基因遗传变异分析

为掌握江西省猪伪狂犬病病毒（PRV）的分子流行病学及遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2018年采集自江西南昌、宜春、赣州、吉安、九江、上饶、抚州、新余8个地区的PRV阳性猪病料进行gE和gB基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,共获得64株PRV的gE基因序列和12株PRV的gB基因序列;gE基因遗传进化树表明,64株PRV同属一个大分支,与亚洲毒株及近年来国内分离株亲缘关系较近,全部为GⅠ型,而与GⅡ型的欧美经典毒株亲缘关系较远;江西毒株gE基因与19株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%~100%和94.6%~100%;gB基因与11株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.2%~100%和96.5%~100%;相较于Bartha-K61疫苗株,江西流行毒株的gB基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了江西省PRV的流行与变异情况,为江西省科学防控PRV提供理论依据。     

3株鸡传染性贫血病毒的全基因组序列分析

通过对3株鸡传染性贫血病毒(CIAV)的全基因组序列比较分析,部分表明广西南宁鸡群CIAV毒株的遗传变异特征。将阳性CIAV的组织样品进行DNA抽提后,运用PCR方法分段扩增CIAV的全基因组,将获得的PCR产物进行基因克隆并进行阳性克隆菌鉴定后送测序。将所获得的基因序列进行拼接成CIAV基因组全长后,应用LaserGene7.1和MEGA4.1软件对CIAV全基因、Viral protein 3(VP3)、Viral protein 1(VP1)和Viral protein 2(VP2)基因序列进行核苷酸、氨基酸同源性分析和遗传进化分析;并对VP1、VP2和VP3蛋白上与毒力、蛋白磷酸酶活性和细胞凋亡相关的氨基酸位点进行分析。结果获得3株CIAV的全基因序列,分别命名为GX1801、GX1804和GX1810;CIAV全基因遗传进化分析表明GX1801、GX1804和GX1810均同属于Group A群,与国内强毒株GD-103和GD-104毒株的亲缘关系较近;基于VP1基因构建的遗传进化树与全基因构建的进化树最相似;GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白上与毒力相关位点的第75、89、125、141、144、394位氨基酸位点与日本强毒株C368株、国内强毒株GD-103和GD-104株在同一位点保持一致;GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上与磷酸酶活性相关的基序(I^94CNCGQFRKH^103)均未发生变异;GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白与诱导细胞凋亡相关的重要区域(VP3蛋白N端结构域的第1~69位氨基酸)均高度保守。本研究对3株CIAV全基因组进行测定并进行基因分析,获得了其基因组特征,为进一步研究广西CIAV的分子流行和致病性提供参考。     

南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西南宁地区犬细小病毒（CPV）的流行现状与病毒变异情况,本试验对初步确诊为犬细小病毒病的12份阳性病料提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因序列并测序,将12个阳性毒株样本VP2基因测序结果与GenBank中登录的17株国内外CPV分离株VP2基因进行同源性比对,采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树,分析其病毒亚型和遗传进化情况。结果显示,成功扩增得到12个毒株样本的VP2基因片段,大小约1 755 bp,12株阳性样本毒株的VP2基因同源性在99.2%~100.0%之间,其中NN01与NN07、NN02与NN06同源性最高,为100.0%;阳性样本毒株与国内其他分离株VP2基因的同源性为97.6%~100.0%,其中NN08、NN10及NN04与CPV-ZJ1579同源性最高,均为100.0%,属于CPV-2a亚型;阳性样本毒株与国外代表性毒株同源性在98.1%~99.8%之间。遗传进化树分析表明,12个样本毒株中有3株属于CPV-2a亚型,3株属于CPV-2b亚型,6株属于CPV-2c亚型。这是继2018年初广西分离到CPV-2c型CPV后,首次发现南宁地区大规模流行CPV-2c亚型病毒,预示着CPV-2c亚型CPV在国内的流行正在增加。综上所述,广西南宁地区CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型并存,但CPV-2c亚型的比重比其他地区大,这也给该地区提供了新的防治信息,在实际CPV防控工作中除了对CPV-2a、CPV-2b等传统流行亚型的关注之外,更应该重视CPV-2c亚型CPV的防控。     

猫细小病毒CC 1株VP1基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒(CU-4)VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。     

猫细小病毒CC-1株VP1基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒(CU-4)VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。     

鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

2015年-2016年度南宁部分地区猪戊型肝炎病毒基因型分析

为了解广西猪群中戊型肝炎病毒(HEV)基因型,利用套式RT-PCR用对南宁周边猪场采集到的104份新鲜猪粪便进行HEV检测、分离并成功扩增和克隆了11株阳性毒株的ORF2基因部分保守片段.序列测定结果表明,11株HEV ORF2序列自身核苷酸同源性为97.7%~100%,推导编码的氨基酸同源性为97.9%~100%;与4型HEV代表毒株Ch-S-1、Ch-T11、swGX40等的核苷酸同源性为84.6%~90.6%,而与其他各型之间的同源性较低.系统发育进化树结果表明,11株HEV广西株为基因4型,其中,10株HEV为4a亚型,1株毒株为4e亚型.结果表明,广西猪群中流行的HEV均为基因4型,且以4a亚型为优势流行毒株.     

血清4型禽腺病毒广西分离株GX2019-010全基因组测序与分析

为了解广西地区血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的基因特征,本研究对实验室前期分离的一株FAdV-4（命名为GX2019-010）进行了全基因组测序,对所获核苷酸序列进行同源性比对和遗传进化分析,并进一步分析了主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列。结果显示,GX2019-010全长43 719 bp,GC含量为54.9%,主要包括43个潜在蛋白质编码区域。核苷酸序列同源性比对发现,GX2019-010与致病株MX-SHP95的同源性为95.8%,与非致病株ON1和KR5同源性分别为95.0%和95.2%。遗传进化分析显示,GX2019-010与中国FAdV-4近几年的流行毒株在同一分支,而与国外FAdV-4毒株不在同一分支,说明FAdV-4存在遗传差异,主要的差异存在于基因组的右端,国内分离株均出现1 966 bp的缺失,其中包括ORF19、ORF48和ORF27基因的缺失,说明中国流行的FAdV-4具有地域性。对主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列分析发现,3个主要结构蛋白均有氨基酸位点的突变,其中Fiber-2的突变位点最多。本研究丰富了广西地区FAdV-4的基因库,为今后心包积液-肝炎综合征（HHS）的防控及流行病学调查研究提供了参考依据。