鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

为建立鸭骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定方法,以高邮鸭13胚龄的胸肌和腿肌为材料,采用混合酶消化法和差速贴壁法分离纯化骨骼肌卫星细胞,用特异性标志Pax7对纯化细胞进行免疫荧光鉴定.结果表明胸肌和腿肌都能成功获取骨骼肌卫星细胞,细胞增殖旺盛,分化良好;纯化后的细胞免疫荧光鉴定阳性率达95％.表明该技术能成功分离和鉴定鸭骨骼肌卫星细胞,为以后骨骼肌卫星细胞相关研究提供了技术平台.     

鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞分离培养及生物学特性

为研究鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞生物学特性,取30～50日龄鲁西黄牛胚胎四肢骨骼肌,分离培养鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞.结果显示,试验成功地分离了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞,原代培养并传代至16代,免疫细胞化学染色检测卫星细胞表面特异性标志Desmin、MyoD呈阳性表达,RT-PCR检测Desm in、c-Met、Myf5、pax7呈阳性表达;绘制生长曲线,结果说明细胞具有较强增殖能力;应用流式细胞仪对细胞进行周期分析,结果显示S期细胞所占比例为8.94％;骨骼肌卫星细胞向成肌细胞诱导10 d后,免疫细胞化学染色检测成肌特异性标志骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达;骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞诱导7d后,油红O染色呈阳性,RT-PCR检测脂肪细胞特异性标志pparγ、LPL呈阳性表达.结果表明试验成功建立了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞的体外扩增培养体系,且该骨骼肌卫星细胞有发育形成肌管和脂肪细胞的多项分化潜能.     

猪骨骼肌卫星细胞体外培养

探索和建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。结果表明,通过机械法与酶消化法相结合的方法,15%血清完全培养液分离、培养细胞效果最好,对培养细胞进行了形态观察、生长曲线测定、染色体分析。结果表明,培养的细胞具有正常的大小、形态和染色体数目,该方法所获得的猪骨骼卫星细胞可在体外稳定培养,为有关实验提供充足的猪骨骼卫星细胞。     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P0.01);CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著(P0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。     

小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定

采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示:分离出的肌卫星细胞生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,诱导分化形成肌管后,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞,并具有很好的体外分化能力,可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。     

安淮山羊骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

为了分离得到安淮山羊骨骼肌卫星细胞,成功构建山羊骨骼肌卫星细胞系,为相关研究提供实验材料。以安淮山羊背最长肌肌肉组织为材料,采取胶原酶和胰蛋白酶结合的二步消化法,结合差速贴壁法纯化原代骨骼肌卫星细胞。对骨骼肌卫星细胞中特异性基因Pax7用免疫荧光染色法及PCR扩增加以鉴定。通过分离、纯化,得到纯度较高的山羊骨骼肌卫星细胞,其形态为圆形,折光性强。培养一段时间后密度增大,细胞呈梭型。所得骨骼肌卫星细胞生长状态良好,具有较为一致的生长方式和形态特点。经免疫荧光染色法以及PCR鉴定发现细胞系中有Pax7基因的表达。通过上述材料和方法,可获得较纯的山羊骨骼肌卫星细胞,并稳定传代。     

猪骨骼肌卫星细胞体外培养体系的建立

为了完善猪骨骼肌细胞的分离培养方法,为有关试验提供细胞,通过改进骨骼肌细胞的取材、分离、消化、培养、冻存、复苏等技术,从细胞形态学及细胞计数观察细胞培养情况。结果表明,改良的方法分离、培养猪骨骼肌细胞具有简便、稳定性强、细胞产量高和质量好的特点。     

北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究

【目的】探讨体外培养条件下北京油鸡骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定的方法,建立适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,为今后进一步研究北京油鸡骨骼肌卫星细胞提供技术平台。【方法】以15日龄的鸡胚胸肌为材料,采用联合酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化细胞,使用Pax7、Desmin、Myod等骨骼肌卫星细胞的特异性标志对所得细胞进行免疫荧光鉴定,随后进行成肌诱导分化,并比较了3种培养体系对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。【结果】细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,证实所培养的细胞为北京油鸡骨骼肌卫星细胞;成肌诱导后,细胞相互融合形成多核的肌管,成肌特异性标志MHC表达呈阳性;对不同扩增培养体系比较,结果表明,培养体系DMEM/F12+15%FBS+2.5ng·mL-1bFG最有利于北京油鸡骨骼肌卫星细胞的增殖。【结论】该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡骨骼肌卫星细胞体外扩增的培养体系,同时成功地进行了成肌诱导分化,为今后研究北京油鸡骨骼肌生长和发育的机理提供了技术平台。     

猪骨髓基质细胞的分离培养及生物学特性研究

【目的】探讨猪骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的体外分离培养方法,并对猪BM-SCs的生物学特性进行研究,旨在建立一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。【方法】分离刚出生猪的BMSCs进行体外培养,传代,分别观察原代及传代细胞的形态和分化特征,绘制生长曲线,测定细胞分裂指数和贴壁率。采用细胞免疫化学染色对碱性磷酸酶(ALP)进行检测,以确定成骨分化能力,并通过免疫组化法对表面分子CD44、CD34进行染色鉴定。【结果】猪BMSCs体外生长良好,细胞接种后1~2 d生长缓慢,2~5 d进入对数生长期,6 d后细胞数开始下降;猪BMSCs在第4天分裂指数最高,约为10%;猪BMSCs传代后10 h贴壁率最高,达90%以上。猪BMSCs ALP染色阳性率达到75%;CD44阳性率可达98.83%,而CD34在第2代后消失;猪BMSCs在第5代以前生长形态稳定,培养至7代后,衰老现象严重。【结论】该方法分离的猪BMSCs早期生长性状稳定,增殖速度快,并获得了高纯度的猪BMSCs,据此建立了一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。     

猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定

上海市农业科学院畜牧兽医研究所在上海郊区分离到一株猪流行腹泻病毒，以人工攻毒发病猪的小肠粘膜无菌处理后接种已长成单层的ＶＥＲＯ传代细胞，并在维持液中加入胰酶５０μｇ／ｍＬ和２％的小牛血清。     

猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞的分离培养

为了获得高纯度的猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,对猪子宫内膜进行胶原酶消化,分离基质细胞和腺上皮细胞进行体外培养,研究其生长特性.结果表明:猪子宫内膜组织在37℃、通过1 g/L胶原酶Ⅰ消化90 min可以获得游离的腺体,对腺体进行培养时上皮细胞比例可达70％以上.培养过程中采用差速消化和差速贴壁可以成功分离腺上皮细胞和基质细胞.基质细胞最适贴壁时间为25 min,腺上皮为3h.纯化的基质细胞生长迅速,可传5代以上,上皮细胞生长缓慢,并且成片脱落.     

骨骼肌卫星细胞生物学特性及在肌肉损伤修复中的应用前景

卫星细胞是生肌干细胞的唯一来源.卫星细胞在骨骼肌受到损伤后的修复过程中起着超乎寻常的作用.综述了骨骼肌卫星细胞的生物学特性以及其在在肌肉损伤中的修复作用,并对其在临床应用中的前景进行了展望.     

PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分...     

山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化

【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基（20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素）培养于37℃、5% CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、MyoD1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基（2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素）,诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成cDNA后,利用qPCR测定MyoD1和Myog的相对表达量。【结果】 分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和MyoD1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,qPCR结果显示,标志基因MyoD1和Myog均有表达,且MyoD1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外原代培养的试验研究

对大鼠骨骼肌卫星细胞体外原代培养方法进行研究,以得到高纯度的骨骼肌卫星细胞,为转基因等试验研究提供充足的试验材料。用0.1%Ⅱ型胶原酶消化法从18日龄SD大鼠后腿部肌肉分离出骨骼肌细胞并培养5日,再利用差速贴壁法分离得到高纯度的骨骼肌卫星细胞。研究结果表明,采用此方法分离得到纯度较高的骨骼肌卫星细胞,细胞增殖快,生长良好。     

杨木变色菌的分离鉴定及其生物学特性的研究

通过对杨木变色菌的分离鉴定,得到变色菌可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)和新月弯孢(Curvularia lunata),并对这两种变色菌的生物学特性进行了研究.结果表明,两种变色菌对强酸性条件比较敏感,最适pH生长范围均为5～8;可可球二孢在20～35℃生长较好,最适生长温度为30℃;新月弯孢在25、30和35℃时生长量差异不显著.光照能够促进两种变色菌的生长.     

牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。