虾肝肠胞虫的检测与控制技术研究进展

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei),又名肠道上皮细胞孢子虫,于 2003 年被 Chay-aburakul等[1]首次发现,2009 年由 Tourtip 等[2]从生长缓慢的斑节对虾(Penaeus monodon)中分离并命名,主要感染斑节对虾、凡纳滨对虾(Litopenaeu...     

中华绒螯蟹微孢子虫全基因组分泌蛋白的预测分析

本试验运行真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred 2.0在中华绒螯蟹微孢子虫全基因组范围内预测分泌蛋白,同时分析分泌蛋白的序列特征,注释功能.结果表明,分泌蛋白序列长度大多为30～300 aa;信号肽长度为11～23 aa;信号肽切割位点处主要由疏水性氨基酸组成;对预测所得蛋白质功能的注释,发现了多种关键蛋白,如血...     

3种虾肝肠胞虫PCR检测方法的应用比较分析

虾肝肠胞虫被认为是凡纳滨对虾"长不大"现象的主要病原之一,国内外学者已建立其PCR检测技术,包括18S-PCR、SSU-PCR及SWP-PCR。采集36个凡纳滨对虾苗种样本、5个卤虫样本和12个水样,应用上述3种PCR方法进行检测,并对阳性产物进行克隆测序和序列同源性分析,以比较检测灵敏度和准确性。试验结果显示,18S-PCR在第一步扩增的灵敏度最好,SSU-PCR在第二步扩增的灵敏度显著高于SWP-PCR,但存在着一定的假阳性现象。建议在对凡纳滨对虾苗种进行虾肝肠胞虫的检测时,宜采用灵敏度更高的套式SSU-PCR方法。     

虾肝肠胞虫(EHP)孢子的纯化和计数

采用差速离心和密度梯度离心,从感染虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)对虾的肝胰腺中,尝试纯化出孢子,并应用透射电镜、荧光桃红染色和血球计数板计数的方法对纯化出的孢子进行了观察和计数。结果表明,从1g的EHP载量为(4.7±2.2)×104 copies/ng DNA的肝胰腺组织中经差速离心和密度梯度离心方法分离到EHP的孢子,电镜观察孢子为大小在0.7～1.2μm的椭圆形,纯化孢子悬液用血球计数板计数显示孢子浓度为5.30×103个/μL,蔗糖密度梯度中的纯化孢子区带含有的孢子总数约1.06×106个。     

虾肝肠胞虫感染对脊尾白虾肠道菌群的影响

为探究虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)感染对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)肠道菌群的影响,本研究基于16S rRNA基因的测序结果,对感染EHP的脊尾白虾肠道菌群进行了分析。结果显示,感染虾与健康虾肠道菌群差异较大,且其肠道菌群结构多样性显著低于健康虾。研究发现,病虾中归属于变形菌门(Proteobacteria)的脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、未分类蓝细菌科(unidentified Cyanobacteria)、支原体科(Mycoplasmataceae)和未分类α变形菌科(unidentified Alphaproteobacteria)为优势菌,而归属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌科(Lactobacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)及噬几丁质杆菌科(Chitinophagaceae)细菌在健康虾中占据优势地位。EHP侵蚀导致感染虾肠道内潜在致病菌显著增加(P<0.05),增加了其他疾病的易感性。此外,通过Tax4Fun功能预测,发现感染虾肠道菌群主要用于新陈代谢,从而抵抗EHP侵染,维持机体正常功能;健康虾肠道菌群则多用于个体生长与环境信息处理,进而保证生长与存活。本研究从虾肠道菌群结构方面入手,进一步探究了EHP感染对脊尾白虾肠道菌群的影响,以期为EHP的防治提供帮助。     

凡纳滨对虾感染虾肝肠胞虫的群体及组织间差异性分析

对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体进行了对虾生长参数测量,用Taq Man q PCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)。结果显示,在主要生长相关参数中,RZ群体最优,该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异,HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布,而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布,代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中,各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺中肠血淋巴鳃肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(P0.001);除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外,其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P0.01)或显著(P0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示,肝胰腺是主要的EHP感染组织,其他组织中杂交信号较弱,但各组织中有少数细胞的EHP易感。     

虾类肝肠胞虫流行病学研究进展

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)作为虾类养殖过程中的重要病原之一,会导致虾类生长缓慢甚至停滞,极大的影响了养殖业的经济效益。该文就虾肝肠胞虫的流行情况、致病机理、传播途径、检测方法及防治措施等方面进行了综述,以期为虾类肝肠胞虫的研究和防治提供参考。     

虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大,已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针,通过优化反应条件,建立检测EHP的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法。建立的方法呈良好的线性关系(R²=0.998),灵敏度是巢式PCR的10倍。特异性试验表明：检测其他常见病原均为阴性,特异性好;重复性试验显示：批内批间变异系数均小于1.5%,重复性良好;对临床样品检测,与巢式PCR的符合率为97.81%。使用该方法对中山市、江门市和珠海市珠三角部分地区南美白对虾开展EHP流行病学调查,其中虾苗检出率为10.75%,成虾检出率为54.07%,部分区域检出率较高,要防范爆发风险。本研究建立的实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性和重复性良好,具有较好的应用前景。     

草鱼含信号肽分泌蛋白的预测分析

采用组合的信号肽分析软件SignalP 3.0,TMHMM 2.0,big-PI,TargetP 1.1和Lipop 1.0对已公布的522个草鱼ORF编码蛋白的N端氨基酸序列进行信号肽分析,同时系统分析了信号肽的类型及结构。结果表明,522个草鱼氨基酸序列中分泌蛋白有61个,占其基因组编码蛋白的11.7%。编码这些蛋白的可读框(ORF)最小值为127 bp,最大值为5032 bp,平均910 bp,引导它们的信号肽长度介于15～32个氨基酸之间,平均为21个氨基酸。通过对草鱼分泌蛋白切割位点信号肽类型分析发现具Ⅰ型信号肽的分泌蛋白有17个,Ⅱ型的有4个。草鱼分泌蛋白中,42个具可预测功能,19个为未知功能蛋白。已知功能的分泌蛋白主要集中于细胞代谢,细胞调控及转运,细胞膜结构,细胞的免疫等领域。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法.结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101-8.3×108 copies/μ1的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=-3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992),扩增效率为98.1％,检测灵敏度下限为8.3× 10(1) copies/μ1,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性.对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍.利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平.本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考.     

基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

检出虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体的体长和体重关系

对采自天津、浙江和山东等养殖场5个凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei)群体的442尾个体进行虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的TaqMan探针荧光定量PCR检测,并测量各群体每尾对虾的生物学体长和体重.引入医学上的劳累尔(Rohrer)体重指数(Ponderal index,PI,W/L3)关系建立对虾体重(W)和体长(L)关系函数.结果显示,4个凡纳滨对虾的EHP阳性群体[平均体长为(5.37±1.19) cm]的体重指数PI平均值为(5.19±0.26)×10-3 g/cm3,EHP阴性群体的凡纳滨对虾群体[平均体长为(2.49±0.21)cm]为(7.96±0.51)×10-3 g/cm3,根据PI=a·L(b-3)的函数矫正EHP阴性和阳性群体的体长差异引起的PI差值后,同等体长EHP阳性群体的PI值为阴性群体的(70.5±8.7)％,表明同样大小的个体,EHP阳性群体的平均体重比阴性群体平均体重低30％;EHP阳性群体中凡纳滨对虾体长和体重的变异系数是EHP阴性群体的(2.39±0.93)和(2.05±0.86)倍,表现为对虾EHP阳性群体个体大小不均匀;EHP阳性群体体重偏差率是EHP阴性群体的2.34-3.45倍,体长相同时,EHP阳性的体重波动变大.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及虾肝肠胞虫(EHP)的荧光定量PCR检测

2013年,河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗期出现死苗、出苗率低的情况,生产上,仔虾个体大小差异较大,造成了严重损失.本研究采用荧光定量PCR方法(Real-time PCR)对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测.结果显示,传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)均有检出.IHHNV阳性检出率100％,每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数为103-107,且个体较大的样品(1.2-2.0 cm)携带病毒拷贝数偏高;EHP阳性检出率为49.1％,每微克对虾组织DNA的拷贝数为103-105,且集中于个体较小样品(0.7-1.1 cm).对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析,显示IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关,虾组织IHHNV平均载量达8.51×104 copies/μg DNA,为较高的感染水平;EHP的载量与对虾生长速率呈负相关关系,与较大个体阳性检出率较低相对应,虾组织EHP平均载量达到2.19× 104 copies/μg DNA,为较高的感染水平.由此,该批凡纳滨对虾仔虾患病为IHHNV和EHP的混合感染所致,本研究数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据.     

南美白对虾肝肠胞虫的分离及形态学观察

为了研究江苏地区感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的形态学特点,分析与国外报道的差异性,本研究以江苏地区感染肝肠胞虫的南美白对虾肝胰腺组织为研究材料,通过蔗糖密度梯度离心等方法进行肝肠胞虫初步分离纯化,构建一种肝肠胞虫荧光染色检测方法,显微观察肝肠胞虫的孢子形态结构。结果发现感染江苏地区南美白对虾的肝肠胞虫孢子主要分布在35%~40%浓度的蔗糖层面,可推算其密度为1.15~1.17 g/m L。荧光显微镜下可见孢子椭圆或圆形,呈亮蓝色,孢子微小但可计数,显微观察可见肝肠胞虫孢子大小约为1.7μm×0.9μm,外壁上有大量白色瘤状物,疑似胞壁蛋白,孢子表面布满细小褶皱,孢子具有一个细胞核,极丝4~6圈,细胞壁由一相对薄的电子透亮的孢子内壁和电子致密的孢子外壁组成。结论认为江苏地区南美白对虾肝肠胞虫的形态结构与国外报道的吻合,本研究建立的肝肠胞虫分离纯化、荧光染色方法以及取得的肝肠胞虫形态学资料可为其检测和研究提供参考。