副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析

文章采用琼脂稀释法检测从养殖患病对虾中分离的36株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对16种药物的耐药性,并用PCR法检测喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS和qnrVC,酰胺醇类耐药基因cat、optrA、floR和cfr,四环霉素类耐药基因tetA、tetB和tetM,磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3,氨基糖苷类耐药基因strA、strB、aadA和aacA,利福霉素类耐药基因arr,β-内酰胺类耐药基因bla CARB和大环内酯类耐药基因erm的携带状况,分析其耐药表型和基因型之间的相关性。结果显示,36株副溶血弧菌对β-内酰胺类药物氨苄西林耐药率最高(88.9%),其次为磺胺类药物磺胺甲噁唑(66.7%),硫酸新霉素、庆大霉素、头孢曲松和美罗培南呈现100%敏感。多重耐药副溶血弧菌比例高达61.1%(22/36),其中1株对6类抗菌药耐药。喹诺酮类耐药基因qnrVC检出率最高达72.2%(26/36);其次为氨基糖苷类耐药基因srtB,检出率58.3%(21/36);大环内酯类、利福霉素类耐药基因均未检测到。耐药基因检出率与耐药表型没有表现出一一对应的关系,提示副溶血弧菌耐药的复杂性。     

副溶血弧菌对斑节对虾和日本对虾的致病力研究

作为条件致病菌的弧菌,前人对其致病性已作了大量的研究,但不同研究者得出的结果很不一致,有的甚至相互矛盾［1－4］,其差异主要在于浸泡感染能否使健康对虾致病。因此,本实验以不同的感染方式以及不同的实验条件,对斑节对虾体内分离出的副溶血弧菌的致病力进行研究,以便了解对虾弧菌病的发病条件。１材料与方法１.１材料 对虾：体长７～９ ｃｍ的健康斑节对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｎｄｏｎ）和日本对虾（Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）,直接购于养殖场。 菌株：对虾病原菌一副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｏｒａ－ｈａｅｍｏｌｙｔｉ…     

一株副溶血弧菌的分离和鉴定

从患病的凡纳滨对虾体内分离了一株致病菌。对该菌进行了常规的生理生化鉴定,确认该菌为副溶血弧菌;该菌在第6 h就进入对数早期,对数期一直持续到22 h;用该菌腹腔注射小白鼠,对小白鼠半数致死量LD50为7.6×106cfu/g。     

一株副溶血弧菌噬菌体的分离与鉴定

分离到2株副溶血弧菌噬菌体,筛选出其中具有强裂解性的1株.该噬菌体的噬菌斑中心清亮,边缘有晕环.12 h观察,噬菌斑直径约3 mm,效价为1011pfu/ml.该噬菌体的核酸为线型双链DNA,大小约4 kb.电镜观察显示,头部为正二十面体,直径约110 nm,有尾,尾长约270 nm,底部有3个刺突.按国际病毒分类委员会第五次报告的分类标准,该噬菌体具肌尾噬菌体科的特征,与其他副溶血弧菌噬菌体比较显示,该噬菌体可能是一种新型的副溶血弧菌噬菌体.     

2株副溶血弧菌不同盐度下致病性和毒力基因差异分析

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是常见的食源性致病菌和海水养殖动物致病菌,目前已知的毒力基因有tlh、tdh、trh、T3SS、pirA、pirB、toxR/S、orf8等。盐度是影响细菌基因表达的关键生态因子之一,为进一步探求副溶血弧菌的致病机理,对2株分别分离自海水和淡水养殖发病凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中的副溶血弧菌在不同盐度下的生长速率、致病性进行检测,并用q-PCR方法对菌株毒力基因携带和表达情况进行定量研究。实验结果表明:海水菌株383生长速率快于淡水菌株V9,但菌株383在生长稳定期的细菌浓度明显低于菌株V9;菌株383对凡纳滨对虾的致病性明显高于菌株V9,前者的48 h半致死浓度(LD_(50))低于后者2个数量级;2株副溶血弧菌皆携带毒力基因tlh、T3SS1和pirA/B,但未检测到tdh、trh、T3SS2、toxR/S和orf8。部分毒力基因表达量检测结果显示,菌株383和菌株V9均为vcrD1表达量最高,其次是pirA,vopD1表达量最低;4个毒力基因不仅在2菌株间的表达量差别较大,而且盐度对同一菌株不同毒力基因表达的影响也是不同的。2株副溶血弧菌的毒力与pirA和vcrD1的表达量呈正相关性。研究结果为探究环境因素与副溶血弧菌致病力的关系提供了科学依据,同时也提示,淡水养殖凡纳滨对虾要防范副溶血弧菌输入的风险。     

对虾源副溶血弧菌强毒株HNBX-1的分离鉴定与毒性分析

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海水养殖中常见的条件致病菌,具有发生率高和流行面广等特点。本文从患红体病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内分离得到一株细菌HNBX-1,经生化实验结合热休克蛋白60(Heat Shock Protein 60,HSP60)基因鉴定为副溶血弧菌。毒性实验表明,弧菌HNBX-1对凡纳滨对虾的毒性极强,感染24 h时的LD50为3.5×104cfu·mL-1;对其重要毒力基因———耐热溶血毒素基因(TDH)、耐热溶血毒素相关基因(TRH)和Ⅲ型分泌系统(T3SS1和T3SS2)的分析结果显示,HNBX-1中的TDH、TRH以及T3SS2基因检测结果均为阴性,而T3SS1的4个毒力基因中的VP1689(vscK)和VP1694(vscF)基因扩增为阳性,表明该副溶血弧菌菌株的强毒特性与其携带的T3SS1密切相关。     

副溶血弧菌致病因子与耐热直接溶血毒素的研究进展

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,作为人类致病菌它能够在很广的范围内造成由食物中毒引起的肠胃炎和败血症[1-2].该菌最早是由Fujino等[3]在日本发生的一次爆发性食物中毒中发现并成功分离的一种多形态杆菌,其在不含盐的培养基内不能繁殖,而在含盐浓度较高(超过3%)的培养基中生长旺盛,并广泛存在于海岸和海水中.     

水体使用副溶血弧菌噬菌体对对虾体内宿主的防治研究

研究在水体使用噬菌体对感染病原菌对虾的治疗效果。在水体使用浓度分别为1×106,1×105,1×104pfu/mL的噬菌体对人工感染副溶血弧菌的凡纳滨对虾进行生物防治实验。结果显示,施加噬菌体的实验组对虾的死亡率明显低于对照组,对虾发病症状也较轻。凡纳滨对虾各组织器官含菌量实验表明,噬菌体对水体宿主裂解的同时,对虾体内器官的副溶血弧菌也被明显清除。水体中加入噬菌体使感染副溶血弧菌对虾体内的血细胞含量保持相对稳定。水体使用噬菌体对对虾副溶血弧菌病有积极的治疗作用。     

广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌3种毒力基因检测及tlh基因的蛋白表达

采用PCR技术检测分离自广西钦州、北海和防城港3市凡纳滨对虾样品中的67株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)3种毒力基因tdh、trh和tlh的携带情况,并将tlh基因进行原核表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,67株副溶血弧菌均未扩增出tdh和trh基因,而tlh基因检出率为100.0%,所检副溶血弧菌的毒力基因型为tdh~-trh~-tlh~+。成功构建了原核表达质粒pET-28a-tlh,将其转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测得到大小约为53 kDa的产物,与预测值相符。经Western blotting鉴定,该重组表达产物能与抗6×His标签的单克隆抗体发生特异性反应。     

中国对虾糠虾幼体病原哈氏弧菌的鉴定及毒力基因检测

2011年春季对江苏连云港某对虾育苗场中国对虾Fenneropenaeus chinensis病死糠虾幼体分离到优势生长菌,对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及16S rRNA和gyrB基因同源性与系统发育分析。结果显示,引起糠虾幼体大量死亡的病原为哈氏弧菌Vibrio harveyi,菌株kx1对中国对虾仔虾和日本对虾仔虾的半数致死量LD50分别为2.0×106CFU/ml和7.0×105CFU/ml。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,进行了分离鉴定的4株病原菌对群体效应调节基因(luxR)、毒力调控基因(toxR)、溶血素基因(vhhA和vhhB)、金属蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、毒力相关基因(toxS)、鞭毛结构基因(flaA)及锌金属蛋白酶基因(pap6)共9种毒力基因的检测,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB和pap6毒力基因,扩增片段大小分别为679、390、1324、216和355 bp,其他4种毒力基因未检测到。分离鉴定的4株病原哈氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈氏弧菌的生物学标记。     

克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性

为了净化水产养殖环境,减少克氏原螯虾(Procambarus clarkii)由于养殖规模不断扩大而感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)导致的大量死亡,寻求安全有效的防治措施,开展了克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性试验。2018年5月从湖北省公安县某养殖场采集到一批患病的克氏原螯虾,解剖后发现病虾的肝胰腺肿大发黄,肠道内无食物,有类似肠炎症状,从肝胰腺中分离出的致病菌经TCBS培养,得到光滑蔓延生长的菌落,呈蓝绿色斗笠状,菌落大小不一。显微观察发现细菌形态为棒状或弧状,长短不一,革兰氏染色呈红色,属于革兰氏阴性菌,细菌形态单一;通过分析其16S rDNA序列和生理生化特征,鉴定为副溶血弧菌并命名为Vp-2,其与弧菌属种类同源性最高,并与菌株Vibrio parahaemolyticus DQ068942.1的亲缘关系较近。通过纸片扩散法进行药敏试验,该菌株对氟苯尼考、卡那霉素、复方新诺明等7种抗生素敏感;对利福平、磺胺异恶唑、庆大霉素耐药。生理生化特性测定结果显示,菌株Vp-2的理化特性基本与标准菌株一致。人工回感试验表明,发病克氏原螯虾的症状与自然...     

对虾养殖池中一株弧菌拮抗菌的分离鉴定

从对虾养殖池中分离出1株编号为2013082515(简称菌株15)的菌株,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为指示菌,分析了菌株15对指示菌的抑菌效果及最低抑菌浓度,同时,分析了菌株15对其他7株弧菌的抑菌效果.结果显示,菌株15对3株指示菌均具有抑菌效果,对鳗弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌的最低抑菌浓度分别为2.50×104、2.50×105、2.50×105 CFU/ml;对其他弧菌也具有一定的抑菌效果.采用注射及浸泡感染方法分析了菌株15对对虾的生物安全性,结果显示,在高浓度时,菌株15对对虾具有潜在毒性.分别用细菌全细胞脂肪酸气相色谱法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行分类鉴定,表明菌株15为一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.).     

一株凡纳滨对虾病原菌的分离、鉴定及其致病力分析

从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的进化地位最接近。综合上述实验结果分析得出,该细菌分离物为副溶血弧菌。     

Identification of Vibrio parahaemolyticus in Seafood by Multiplex PCR

ABSTRACT

Vibrio parahaemolyticus is a human pathogen frequently found in seafood. Once the seafood is contaminated by V. parahaemolyticus, it can become a vehicle for foodborne illness. The conventional culture methods for detection of V. parahaemolyticus are time-consuming and cannot differentiate pathogenic strains from nonpathogenic ones. In this study, a multiplex polymerase chain reaction (PCR) technique was investigated for detecting tdh, chiA, and toxR of V. parahaemolyticus. The sensitivity of the multiplex PCR was determined by testing 28 strains of V. parahaemolyticus, 15 non-V. parahaemolyticus strains, and fresh seafood spiked with cells of V. parahaemolyticus. All the strains were analyzed for production of thermostable direct hemolysin (TDH) and chitinase. This study showed that both the chiA and toxR are excellent markers for detecting V. parahaemolyticus strains, and a multiplex PCR targeting chiA and tdh genes can be applied to simultaneously detect environmental and pathogenic V. parahaemolyticus.     

连云港海域副溶血性弧菌的分布状况及危害性评估

对连云港周边不同海域的海水及海产品中的副溶血性弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ,Ｖｐ）进行分离,对检出菌株进行溶血性及耐药性检测。菌株检出率７８％,溶血素阳性率６８％,文蛤浸养感染率及死亡率２０％ ～３０％;耐药性检测结果表明,其对ＧＮ、ＳＸＴ、ＴＥ、ＣＡＺ、ＣＴＸ、ＣＲＯ、ＣＩ、ＤＯ和ＮＯＲ较为敏感,耐药率低于1０％;对ＦＲ和ＡＭＰ的耐药率在６０％以上。连云港海域内及海产品中均存在副溶血性弧菌的污染,其中ＴＲＨ型毒素分布较多。对海水养殖行业及人体健康具有潜在危险性。     

Occurrence of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus among milkfish farms in Zanzibar

ABSTRACT

Fishing is among the main economic activities of the people of Zanzibar. Few fish dealers are transforming this sector into mariculture. Among the farmed fish is milkfish. Diseases are among the limiting factors in the development of the mariculture industry. Among other zoonotic diseases, vibriosis is caused by bacteria from the genus Vibrio. This study aimed to establish the occurrence of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus among milkfish farms in Zanzibar. A total of 380 milkfish were sampled. Swabs were collected from gills, intestine, and kidney of each sampled milkfish. Preliminary identification of V. cholerae and V. parahaemolyticus was done by biochemical tests. PCR was run on 16S rRNA, outer membrane protein W, and collagenase genes to confirm Vibrio species, V. cholerae, and V. parahaemolyticus respectively. Almost one-third (32.1%) of all sampled milkfish were found to contain targeted Vibrio; 18% and 29.5% of the sampled milkfish were positive for V. cholerae and V. parahaemolyticus respectively.     

乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究

分离到对副溶血弧菌有抑制作用的3株乳酸菌,命名为A-1、A-2、A-3。对其胞外产物的抑制作用进行研究,结果表明:3株乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌有较强抑制作用,抑菌环直径分别可达18.6mm、20.3 mm1、9.5 mm;抑菌物质对热处理不敏感:在60℃、80℃抑菌活性基本不变,在121℃处理20min条件下抑菌效果分别是原液的67%,83%,74%,蛋白酶K处理对其活性有较大影响,抑菌成分可能是细菌素。进一步研究了细菌素抑菌活性与乳酸菌培养时间的关系。根据形态特征和常规生理生化反应进行鉴定,A-1、A-2鉴定为嗜热链球菌,A-3鉴定为嗜酸乳杆菌。     

抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联卵黄抗体的制备及体外抑菌效果的研究

为研究三联特异性卵黄抗体对哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌的体外抑菌效果,通过制备哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联灭活疫苗,免疫蛋鸡。收集鸡蛋制备卵黄抗体并检测其效价、纯度和特异性。通过免疫荧光、扫描电镜和体外抑菌实验初步探究其制备的三联特异性卵黄抗体对三种弧菌的体外抑菌效果。结果显示,ELISA检测特异性卵黄抗体效价高达1:51200,并维持5周;SDS-PAGE对分离纯化的卵黄抗体分析显示,随着纯化步骤的进行,卵黄抗体中的蛋白杂带逐渐减少,纯度变高。免疫荧光和免疫印迹实验表明,特异性卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。扫描电镜进一步观察发现,相比非特异性卵黄抗体,特异性卵黄抗体处理过的弧菌,菌体互相黏附在一起,菌体细胞表面粗糙,细胞壁破损。在体外抑菌实验中,特异性卵黄抗体对弧菌具有明显的抑制效果,且抑制作用呈现剂量依赖性。综上所述,本研究制备的三联特异性卵黄抗体能够与哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌发生特异性结合,通过体外实验发现,卵黄抗体通过凝集和黏附,破坏菌体细胞的完整性,从而发挥抑菌作用。