由牛体外受精胚胎分离胚胎干细胞

以DMEM＋15％NBS＋0．1mmol/Lβ－巯基乙醇＋0．01μmol/L亚硒酸钠＋10μg/L LIF＋10μg/L IGF－1作为培养液，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层，利用8日龄牛体外受精胚胎获得了传3代的牛类胚胎干细胞（类ES细胞）。通过体外分析试验，对所得类ES细胞的多能性进行了鉴定。结果在培养2d后，牛类ES细胞分化形成了类似于扩张囊胚的结构，悬浮于培养液中。     

牛体外受精技术研究

卵巢卵母细胞培养于Ａ、Ｂ、Ｃ三种成熟液内的体外成熟率分别为９４．６１％、８９．４７％和７０．４３％，体外受精率分别为７１．８６％、７８．９５％和４０．８７％。受精卵培养于颗粒细胞单层、输卵管上皮细胞单层和中间受体的２￣４细胞发育率分别为４７．３１％、５４．９２％和６２．８１％，其桑椹胚发育率分别为１０．７５％、１２．３０％和１８．５９％。移植受体１１头，妊娠３头，移植妊娠率为２７．２７％，其中１头     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

牛体外受精胚胎卵裂阶段对其体发育能力影响的研究

将经过体外成熟培养（ＩＶＭ），体外受精（ＩＶＦ）后获得的牛早期胚胎，按其所处卵裂阶段的不同，划分为２细胞、３～４细胞和５细胞以上３个试验组，在体外条件十继续培养到发育囊胚和孵化囊胚阶段，以观察在胚胎早期，受精卵裂发育的快慢与其后胚胎所获得的继续发育能力的关系。结果显示，牛早期胚胎体囊胚发育率的高低，与其在体外培养（ＩＶＣ）前卵裂发育的快慢成正比。在ＩＶＦ后４２～４６ｈ处于２细胞、３～４细胞和５细胞     

影响黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的因素

从屠宰场收集黄牛卵巢,取皮质深层卵母细胞进行体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养,分析了影响其效果的因素。结果表明,在成熟培养液中添加FSH(10IU/mL)、HCG(20IU/mL)和17β-E2(1mg/L)对卵母细胞受精后早期胚胎发育能力有极显著促进作用;等量牛卵泡液(BFF)与新生牛血清(NCS)对体外受精胚胎发育效果影响不显著,以15?F为宜;颗粒细胞与输卵管上皮细胞均能显著提高卵母细胞体外成熟受精后早期胚胎的发育率,颗粒细胞 输卵管上皮细胞对克服胚胎阻滞现象效果显著。     

牛卵母细胞体外受精技术

牛卵母细胞体外受精技术是指卵母细胞在体外条件下与雄配子发生结合,完成受精,发育成胚胎,成完整个体的技术,是适应市场发展,提高国内自主育种水平的高科技手段.体外受精技术可以选择后代性别,加速育种进程,提高受精质量,在科学研究和良种选育中对牛体外受精技术都有很大的需求.因此,本文将从牛卵母细胞的获取、精子的体外获能、体外受精以及胚胎发育和移植四个方面对牛卵母细胞体外受精技术进行简单的介绍.     

牛体外受精胚胎工厂化生产技术的探讨

牛体外受精胚胎工厂化生产的目的是获得大量优良遗传性状的胚胎,用于胚胎移植。作者就该技术的5个主要环节,即活体采卵、体外成熟、体外受精、体外培养、胚胎冷冻及发展前景等作一综述。     

不同共培养体细胞和胎牛血清浓度对牛体外受精后早期胚胎的影响

利用屠宰黄牛的卵母细胞经体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)后的早期胚胎,与单层颗粒细胞(GC)、输卵管上皮细胞(BOEC)等体细胞共培养及在胎牛血清的胚胎培养液中的后续发育进行了研究,并探讨了其影响因素,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明:使用GC和BOEC体外共培养牛体外受精后胚胎,均取得了较好的囊胚发育率;且牛体外受精后早期胚胎体外培养体系中,添加10%血清能有效地促进牛体外受精后胚胎的囊胚率。     

某些因素对牛和小鼠类胚胎干细胞分离与培养的影响

以荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎为材料 ,研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离 ;在 ES细胞分离与克隆中 ,以 15 %～ 2 0 %犊牛血清为宜 ,在 DMEM(L)培养基中添加 0 .1μmol/LNa2 Se O3 0 .1mmol/Lβ-巯基乙醇 10 μg/L IGF 10 0 0 IU/m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;在TCM199、DMEM(高糖 )和 DMEM(低糖 ) 3种培养基中 ,低糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离 ;优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在 37℃用低浓度消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高。     

牛胚胎生殖细胞的分离与培养

以牛胎儿为材料,从原始生殖细胞（PGC）分离培养出胚胎生殖细胞（EG）,并进行传代和鉴定,对影响胚胎生殖细胞分离与培养的因素进行了探讨,研究发现以共培养方式培养牛原始生殖细胞时,原代培养都可以出现大量形态较好的EG细胞集落,说明同源的体细胞可以很好地支持PGC的生长和增殖,组织块培养细胞克隆数目较少,PGC很难增殖,不能形成典型的集落,传代也不理想,只传了一代.同时比较了不同传代方法对牛胚胎生殖细胞细胞传代的影响,发现消化＋机械分离法和消化＋吹打法都可以用于EG细胞的传代.消化＋吹打法操作简单,省时省力,也能够很好的保持细胞的增殖活力.原代培养的牛原代胚胎生殖细胞进行了细胞表面标志抗原SSEA-1,3,4鉴定,呈弱阳性.细胞体外培养可以分化为成纤维样细胞、上皮样细胞和类胚体.     

添加Ge-132对牛体外胚胎发育潜能的影响

试验旨在研究添加羧乙基锗倍半氧化物（carboxyethylgermanium sesquioxide,Ge-132）对牛孤雌激活后胚胎发育率、胚胎细胞数、早期胚胎内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平及胚胎内相关凋亡基因的影响。在牛早期胚胎体外培养基中添加不同浓度的Ge-132（0、10、100和200 μg/mL）,观察其对牛体外孤雌激活胚胎发育的影响;应用Hoechst对孤雌激活后第8天胚胎进行染色后制作装片,在显微镜下对细胞进行计数;用DCFH-DA染色检测早期胚胎内ROS水平,并用Image J测量荧光强度后对数据进行统计分析,用RT-PCR对胚胎内细胞凋亡相关基因（Caspase-3、Bax、Bcl-xl和Survivin）进行分析。结果显示,10 μg/mL Ge-132处理组胚胎率与对照组间无显著差异（P>0.05）,但可降低1细胞期的ROS水平;10 μg/mL Ge-132处理组较对照组早期胚胎细胞数显著增加（P<0.05）;通过检测细胞凋亡相关基因mRNA转录水平发现,与对照组相比,10 μg/mL Ge-132处理组胚胎促凋亡基因Caspase-3表达水平显著降低（P<0.05）,抑制细胞凋亡基因Survivin表达水平显著升高（P<0.05）。结果表明,在早期胚胎培养基中添加10 μg/mL Ge-132可降低细胞内ROS水平,减少胚胎中氧化应激诱导的细胞凋亡,从而提高孤雌激活后牛胚胎的发育潜能。     

家禽胚胎干细胞分离培养的影响因素及其细胞生物学特性鉴定

家禽的胚胎干细胞与遗传工程，转基因技术相结合的综合性研究具有重大的理论意义与实践价值。文章就家禽胚胎干细胞、胚胎生殖细胞研究背景，分离培养的影响因素。生物学特性的检测方法进行了阐述，较为详细地分析了分离培养的影响因素及细胞生物学特性鉴定，并对家禽胚胎干细胞的前景进行了展望。     

牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段     

基因表达差异对牛胚胎发育潜能的影响

随着牛胚胎体外生产(IVP)技术的不断成熟,体外胚胎生产在一些国家已进入商业化运营阶段.但与体内胚胎相比其移植受体妊娠率、产犊率及胎儿的后天发育能力均较差.因此,开发一种既可靠又实用的检测胚胎发育潜能的技术显得尤为重要.应用实时荧光定量PCR技术检测早期胚胎基因表达,通过分析mRNA的表达丰度来评价卵母细胞成熟情况和胚...     

饲养层细胞对胚胎干细胞的影响及其分离培养的影响因素

胚胎干细胞及其相关研究是生命科学领域中最有活力、最有影响力、最有应用前景的研究方向之一，它与遗传工程，转基因技术等相结合具有重大的理论意义与实践价值。饲养层细胞在胚胎干细胞分离培养的过程中起着异常重要的作用。作者结合实践经验就饲养层细胞对胚胎干细胞的影响进行了概述，介绍了饲养层细胞的分类，并分析了饲养层细胞分离培养的影响因素。     

兔胚胎的一些与分离胚胎干细胞有关的生物学特征

为获得具有发育全能性的胚胎干细胞（ＥＳ细胞）,对３日龄、３．５日龄和４日龄家兔胚胎的形态结构和免疫组化特征进行了观察。家兔胚胎的外围,不仅有透明带,还包有一层很厚的胶膜。３日龄兔胚为桑椹胚;３．５日龄胚胎已出现囊胚腔,囊胚腔较小,扩增内细胞团（ＩＣＭ）占据囊腔的１／２～２／３;４日龄为囊胚,囊腔扩大,ＩＣＭ与囊胚腔的体积比值缩小。桑椹胚的卵裂球和３．５日龄、４日龄胚胎的ＩＣＭ,以碱性磷酸酶染色和胚胎阶段特异性细胞表面抗原－１（ＳＳＥＡ－１）免疫荧光标记均呈强阳性,说明它们是由未分化的细胞构成。因此,从保证全能性的角度考虑,３日龄、３．５日龄和４日龄的家兔胚胎,均可用于ＥＳ细胞的分离。     

性别鉴定后胚胎移植妊娠率影响因素分析

对影响后的性别鉴定胚胎移植妊娠率的因素进行了分析。结果表明,性别鉴定胚胎的鲜胚和冻胚移植妊娠率均低于非性别鉴定胚胎,但二者差异不显著(P>0.05),这表明性别鉴定胚胎在生产中应用是可行的。随着胚胎细胞取样数的增多,其移植妊娠率逐渐下降,且冷冻带来的损伤明显增大;性别鉴定胚胎在体外放置时间小于5 h的妊娠率比大于5 h的高,且差异极显著(P<0.01);性别鉴定胚胎移植时受体的最佳移植时间在发情后的7.5~8.5 d;繁殖力好的受体牛移植妊娠率比繁殖力差的受体牛移植妊娠率高,且差异极显著(P<0.01)。