Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测技术研究

通过苏云金芽孢杆菌(Bt)HD-73培养,提取Bt晶体蛋白Cry1Ac,经酶解后获得高抗虫活性蛋白。免疫新西兰白兔得到高纯度的Bt晶体蛋白1Ac抗体,用125I标记抗原,研究和建立了Bt晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测技术,该试剂盒用磁性微粒作分离剂,不需离心即可分离,简化了测定步骤,检测结果达到国外同类产品(酶联免疫试剂盒)的水平。     

转Bt+GNA双价基因抗虫棉对棉铃虫抗性的遗传分析

采用棉铃虫(Helicoverpa armigera)生物测试方法,对转Bt GNA双价基因抗虫棉的抗虫性进行了详细的遗传分析。结果表明：转Bt GNA双价基因抗虫棉纯合品系TBG与6个感虫的常规品种配制正、反交组合F1都高抗棉铃虫,F2和BCl群体中的抗、感虫植株分离结果分别符合3：l和1：1,可以推断TBG对棉铃虫的抗性符合一对显性基因的孟德尔经典遗传规律,而且没有表现出细胞质效应。等位性测验结果显示TBG的抗虫基因与中心94、R19、山西94—24、新棉33B和双抗-l等5个转基因抗虫棉纯合品系(种)中的抗虫基因可能整合在不同的染色体上.     

转Cry1Ac/Sck基因大米的免疫毒理学评价

为观察转Cry1Ac/Sck基因大米对小鼠免疫功能的影响,将BALB/c小鼠按体重分为4组,即转基因大米组、非转基因大米对照组、AIN93G饲料正常对照组和阳性对照组,相应饲料喂养30d,比较各组小鼠免疫功能改变情况。结果显示,转基因大米组血小板数量显著低于非转基因大米对照组,但是与正常对照组无显著性差异,并且这3组血小板数量均在正常变化范围内;其他观察指标转基因大米组与非转基因大米组相比均无显著性差异;阳性对照组的各项指标,绝大多数均显著低于其他3组。表明转Cry1Ac/Sck基因大米对小鼠免疫功能的影响与非转基因亲本大米基本相同,未对小鼠免疫功能产生不良影响,因此转Cry1Ac/Sck基因大米在小鼠免疫毒理学方面的评价是安全的。     

对Bt抗性和敏感亚洲玉米螟解毒酶和中肠蛋白酶的比较

比较了人工汰选的对Cry1Ab杀虫蛋白产生抗性的亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis(Guenée))种群和敏感种群幼虫解毒酶和中肠蛋白酶的变化。结果表明:抗、感种群的乙酰胆碱酯酶、中肠总蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力差异不显著,而抗性种群的α-乙酰萘酯酶和类胰蛋白酶显著高于敏感种群。对类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和类弹性蛋白酶的活力杂交分析结果表明,抗性种群的类胰蛋白酶酶谱强于敏感种群,但抗、感种群中肠液在体外对Cry1Ab原毒素的酶解过程并不存在差异。推断强碱性类胰蛋白酶可能与亚洲玉米螟对Bt抗性产生机理有关。     

不同光质LED光源对转基因杨树叶片Bt毒蛋白含量及叶绿素荧光参数的影响

为探明不同光质对杨树幼苗生长的影响,以转基因741杨株系Pb29为试材,利用LED精量调制光源,设置红光、蓝光、红蓝光、白光4个处理,测定不同光质处理下Pb29的Cry1Ac毒蛋白含量、形态指标、光合色素含量及叶绿素荧光参数。结果表明,蓝光处理下的Cry1Ac毒蛋白的表达量最大,白光次之。除了叶片长/宽的值在蓝光处理下最大外,红蓝光处理下的741杨叶片数、叶片长、叶片宽、叶面积及株高均高于其它处理。除叶绿素b的含量在红光处理下最大外,叶绿素a、叶绿素a+b、类胡萝卜素含量及叶绿素a/b比值均在白光处理下最大,红蓝光次之,且白光与红蓝光间无显著差异。叶绿素荧光参数(ΦPSⅡ、ETR、q P)在蓝光和红蓝光处理下高于其它处理,在白光和红蓝光处理下的Fv/Fm高于其它处理,q N在红光处理下最大。由此可知,不同光质对杨树幼苗的生长具有调控作用。本试验结果为深入研究不同光质对杨树的生长发育进行调控提供了科学依据。     

四价抗病虫除草剂RNAi植物表达载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗是重要的能源作物和糖料作物,面临病虫害日益严重问题。由于甘蔗遗传背景非常复杂,且缺乏必要种质,难以通过杂交培育抗病虫、除草剂聚合品种。基因工程技术提供了新方法。本研究利用BLAST比对获得甘蔗花叶病毒ScMV-CP基因和黄叶病毒ScYLV-CP基因的保守序列作为干扰序列,通过设计内切酶位点、生物合成和连接,获得全长687 bp的两个保守序列融合片段（MYCP）。并将其正向和反向插入中间载体pHANNIBAL上,形成双价病毒干扰结构。再通过在pHANNIBAL上添加SmaⅠ内切酶位点,将双价病毒干扰结构表达框和Cry1AC基因表达框结合;利用NotⅠ酶切,回收双价病毒干扰结构和Cry1AC基因表达框片段,连接到添加Bar基因表达框的表达载体pART27-Z上,构建了抗病虫及除草剂四价植物表达载体（pART27-MYCP-Cry1AC）。采用基因枪法将构建好的四价植物表达载体转入甘蔗品种FN15的胚性愈伤组织中,通过PPT（草丁膦）筛选获得了抗性再生甘蔗植株,经过PCR、定量以及Bt蛋白试纸检测,获得同时整合四种目的基因并表达的四价转基因甘蔗植株,为培育多抗甘蔗新品种提供了材料。     

CrylAb敏感和抗性亚洲玉米螟氨肽酶N基因的克隆及序列差异分析

研究亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)对Cry1Ab产生抗性的分子机理,对今后制定和实施合理的抗性治理策略具有重要的意义。本研究通过PCR方法克隆和测序,鉴定了Cry1Ab敏感-抗性亚洲玉米螟幼虫中肠氨肽酶N(APN)基因家族的一个成员Ofapn3,其cDNA全序列长3591bp,开放阅读框包括3045bp,编码1014个氨基酸。预测蛋白质分子量为115.1kD,等电点(pI)为4.44。其推导的氨基酸序列中具有鳞翅目昆虫氨肽酶典型结构特征,即N-末端具有18个氨基酸的剪切信号肽,谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN,锌结合位点HEXXHX18E,C-末端具有22个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。系统分类归为第3支系。与欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的Onapn3(GenBank登录号:ABL01483)同源性为96.6%。与Cry1Ab敏感亚洲玉米螟cDNA相比,抗性品系的开放阅读框中有40个碱基发生了点突变,导致氨基酸序列中有10个氨基酸改变。其中Ser735在抗性品系中突变为Pro的现象在抗性棉铃虫APN3的氨基酸突变中也被检测到。鉴定的Cry1Ab敏感和抗...     

青花菜锌指蛋白基因BoCCCH1的克隆和表达分析

CCCH锌指蛋白广泛存在于真核生物中,在植物的生长、发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。为获知青花菜CCCH转录因子基因的序列特征和表达特性,从青花菜叶片中克隆到1个CCCH基因,命名为Bo CCCH1,同时,利用RT-PCR方法研究了其在不同器官及霜霉菌侵染叶片中的表达模式。序列分析结果表明,Bo CCCH1的基因组全长为1 568 bp,包含1个长度为599 bp的内含子,2个长度分别为627 bp、342 bp的外显子,编码322个氨基酸,蛋白质的分子量与等电点分别为35 296.42 Da和8.47;Bo CCCH1有2个锌指结构,类型均为C-X8-C-X5-C-X3-H。系统发育分析结果表明,Bo CCCH1与其它植物的21条同源序列在进化树上分为6组,来自十字花科的CCCH与Bo CCCH1处于同一分支。基因表达结果表明,Bo CCCH1在叶、花茎、嫩角果、花蕾和花中表达,其中花茎和嫩角果的表达量最高,但在根中未检测到表达;在霜霉菌侵染下,叶片Bo CCCH1的表达量升高,到24 h和36 h时达到最大,推测Bo CCCH1与霜霉病抗性相关。本研究为进一步探明Bo CCCH1在霜霉病抗性反应中的功能奠定了基础。     

口服急性毒性试验中Cry1C蛋白对鼠肠道菌群的影响

利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析不同ICR(institute of cancer researcch)小鼠在口服急性毒性试验中摄入Cry1C蛋白前后其肠道菌群的变化,进而对该抗虫蛋白的食用安全性进行较为深入的研究.DGGE图谱经UPGAMA聚类分析显示:小鼠间菌群结构存在较明显的个体差异;实验期间,对照组小鼠灌胃前后其菌群基本保持稳定;实验组小鼠试验前后肠道菌群变化差异较对照组明显.随着灌胃的停止其变化差异在经历过高峰后会随着停喂时间的延长而减小,且菌相有逐渐恢复灌胃前结构的趋势.从肠道菌相的角度分析可知:该抗虫Cry1C蛋白对小鼠是基本安全的.     

青花菜BoCHS2基因的克隆、表达和反义载体的构建

根据前期的研究结果设计PCR引物,从青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片基因组DNA和cDNA中克隆到了查尔酮合成酶基因,定名为BoCHS2.BoCHS2的基因组DNA全长为1267bp,具一个长度为85bp的内含子,基因编码区全长为1182bp,编码393个氨基酸.基因序列已提交至...     

苏云金芽孢杆菌S1478—1分离株的特性鉴定及cry1Ac同源基因克隆

本研究对从海南岛尖峰岭热带雨林自然保护区的土壤样品中分离出的＆菌株S1478～1进行了特性鉴定,研究表明S1478—1分离株菌落形态和生长特征和励参照菌株HD73极其相似。16SrDNA序列分析表明,S1478—1分离株与其它＆thuringiensis、B．cereus和B.anthracis的16S rDNA序列相似性达到99％。分离株能产菱形伴胞晶体,SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,菌株在生长后期,形成芽孢同时分泌130kD大小的晶体蛋白。生物测定表明S1478—1分离株对小菜蛾具有很高的毒杀活性,LC50值高达5．159×10^8cfu／mL。初步显示S1478—1分离株可作为防治鳞翅目害虫的生物农药菌株。利用PCR—RFLP方法鉴定S1478—1分离株含有cry1Ac同源基因,以PCR粘性端克隆方法扩增全长基因,序列测定表明该基因ORF为3537bp,编码1178个氨基酸,推定的编码蛋白分子量为133．3kD,与其它cry1Ac基因序列最高达到99％同源,因此,该基因可作为杀虫工程菌及培育转基因抗虫作物的候选基因。     

CryIA(c)转基因结球甘蓝的抗虫性研究

以结球甘蓝（Brassica oleracea var．capitata）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫蛋白基因CryIA（c）导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA（c）和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA（c）基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40％，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。     

甘蓝和青花菜不同器官中莱菔硫烷含量差异研究

十字花科蔬菜含有抗癌活性成分莱菔硫烷,为了筛选富含莱菔硫烷的甘蓝和青花菜材料,本研究以48份甘蓝和29份青花菜为试材,对其不同器官中莱菔硫烷含量进行HPLC分析。结果表明,不同甘蓝和青花菜基因型间莱菔硫烷含量差异显著,青花菜同一基因型不同器官中莱菔硫烷含量差异较大。甘蓝叶球中莱菔硫烷含量变化范围为4.28~57.18 mg·kg~(-1)DW,并平均含量为25.72 mg·kg~(-1)DW,筛选到莱菔硫烷含量较高的甘蓝自交系2份和杂交F1材料1份。青花菜中莱菔硫烷变化范围为:花球:3.58~1 137.47 mg·kg~(-1)DW;幼茎:13.79~259.58 mg·kg~(-1)DW;叶片:0~297.05 mg·kg~(-1)DW。花球、幼茎和叶片中莱菔硫烷平均含量分别为301.23、84.25和47.96 mg·kg~(-1)DW,初步筛选到莱菔硫烷含量较高的青花菜自交系3份。本研究结果为甘蓝类蔬菜新品种选育与改良提供了依据和材料。     

Adsorption of the Bacillus thuringiensis toxin (Cry1Ab) on Na‐montmorillonite and on the clay fractions of different soils

The adsorption of the toxin from Bacillus thuringiensis (Bt‐toxin), which is synthesized in genetically modified maize, on sterilized Na‐montmorillonite and on H₂O₂‐treated and untreated clay fractions of three soils from different sites were studied. All adsorption isotherms can be described by a linear isotherm. Although all clay fractions from the different soils show nearly the same mineralogical composition, we found different affinities ranging from k = 47.7 to k = 366.7 of the adsorbates for the Bt‐toxin. The H₂O₂‐treated clay fractions show no correlation between the adsorption affinity and the amount of soil organic matter. On the other hand, there is a correlation between the content of organic carbon and the adsorption affinity of the untreated clay fractions. This can be explained by the fact that due to the coatings of soil organic matter on aggregates, the Bt‐toxin polymers are not able to adsorb within the clay aggregates.     

双价苏云金芽孢杆菌cry基因载体构建及其在大肠杆菌中表达杀虫活性

研究和利用不同苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫蛋白之间的增效作用是构建高效遗传工程虫剂，预防和延缓害虫抗性的重要途径。BtCry1Ab,Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对重要的鳞翅目农业害虫具有主毒力，质粒pHT-BSK含有能在大肠杆菌（Echerichia coli)－枯草芽孢杆菌（B.subtilis)有效表达的生物安全性标记基因卡那霉素抗性基因。将含Btcry1A,cry1Ac和cry2Aa全长基因的Bam HI/PstI,Bam H I/Xho I和Sma I(Bam H I)HindⅢDNA片段与pHT-BSK的应酶切产物连接，获得了单价cry/km^r组合的重组质粒pBlue-1Ab-km^r,pBlue-1Ab和pHT-2Aa;cry1Ab,cry1Ac DNA片段与pHT-2Aa相应酶切产物相连接获得了Bt双价基因／km^r组合重组质粒pBlue-crylAb-km^r-2Aa和pBlue-cry1Ac-km^4-2Aa，重组质粒中所有cry基因与km^r均形成特异的Bam H I片段。限制酶切电泳分析和特异PCR扩增证实了重组质粒的准确连接。含有重组质粒的大肠杆菌显示了对小菜蛾（Plutella xylostella）和玉米暝（Ostrinia furnacalis)的杀虫活性，对小菜蛾双价基因毒力高于单价基因，但对玉米螟它们之间没有明显差异。研究为进一步阐明Bt cry 2Aa与cry1Ab和cry 1Ac之间在不同微生物细胞中的共表达及其表达产物之间的相互作用和构建双价基因杀虫工程菌株创造了条件。     

植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用

以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。