人趋化因子MIP-lα的克隆及其基因工程菌的构建

通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆并构建了去掉信号肽的人趋化因子巨噬细胞炎性蛋白(Mac-rophage inflammatory protein-1α,MIP-lα)基因的工程菌,并对该基因的结构进行了分析.结果表明,MIP-lα属于4Cys CC趋化因子,具有4个半胱氨酸,含有…CC……C……C……结构,该蛋白的4个保守半胱氨酸形成了两对功能必需的二硫键.     

猪TNF-α高效表达及其多克隆抗体的制备

【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α（TNF-α）多克隆抗体的特异性和反应性,并探索猪瘟病毒（CSFV）感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响,为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA,通过RT-PCR扩增TNF-α基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α并转化BL21感受态细胞诱导表达融合蛋白,经纯化和浓缩后免疫SPF级昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体;同时构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α,分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞表达融合蛋白,通过Western blotting、ELISA和间接免疫荧光分析等方法检测TNF-α多克隆抗体效价、反应性及特异性。【结果】以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白,且主要以包涵体形式进行表达。以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞可表达出25 kD的融合蛋白,主要在细胞质中表达,且均匀分布。制备获得的TNF-α多克隆抗体能与转染HEK-293T细胞表达的融合蛋白TNF-α及PK-15细胞的内源蛋白TNF-α发生良好反应,即具有较好的反应特异性,其抗体效价高达1∶8000。CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上调表达,且TNF-α与其下游因子（TRAF1）的表达变化趋势基本一致,即二者间存在一定关联性。【结论】制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点,可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1产生,参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能,CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致,说明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信号通路,使机体产生炎症反应。     

重组鸭α-干扰素基因工程菌表达条件的研究

为了确定重组鸭α-干扰素(DuIFN-α)基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α的最佳表达条件,对影响原核表达的主要因素:IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对表达质粒的稳定性进行了研究。结果显示,诱导基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α表达DuIFN-α的最佳条件为:以TB+5 g/L葡萄糖培养基37℃培养至菌体OD600=0.8~1.1时,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L,30℃诱导培养4~5 h。在最佳表达条件下,DuIFN-α的相对含量为34.1%,总含量(终菌体浓度×相对含量)达79.9;各种优化条件对表达质粒的稳定性未见明显影响。     

一种鉴定α—淀粉酶活性及其产生菌的新方法

锥虫蓝法是利用锥虫蓝和淀粉交联生成蓝色复合物,淀粉经α－淀粉酶水解后蓝色褪去,出现透胆水解圈这一原理来鉴定α－淀粉酶及其产生菌的。与碘淀粉法的不同之处在于：本法对淀粉酶及其产生菌无任何不良影响。该交联复合物可以经加压灭菌处理;锥虫蓝的适宜使用浓度为０．００５％～０．０１％（Ｗ／Ｖ）;培养基使用量为１５ｍｌ／皿左右（ψ８０ｍｍ）。锥虫蓝法的灵敏度和使用范围与碘淀粉法相同,但以锥虫蓝和淀粉配制的鉴别培养基,在筛选淀粉酶基因时优于常规的碘淀粉法。     

牛生长激素基因工程菌的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30 a和pET29 a),转化E.coliDH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30 a-BST和pET29 a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30 a-BST/RosettaTM和pET29 a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍.     

基因工程蛋白金葡菌α-溶血素的纯化及活性检测

【目的】分离纯化基因工程重组蛋白金黄色葡萄球菌溶血素(α-hemolysin,α-HL)并检测其生物学活性,为疫苗研发奠定基础。【方法】对含pET32a+-α-HL质粒的BL21(DE3)进行诱导表达,诱导成功后,将重组菌BL21(DE3)培养物用超声波裂解,并用凝胶过滤层析法对该基因工程蛋白进行分离纯化,用Bradford法及兔红细胞分别测定纯化产物的蛋白含量和溶血比活。【结果】纯化产物在SDS-PAGE电泳中53ku处呈现出单一清晰带,达电泳级纯度。纯化产物含量约为0.1277mg/mL,溶血比活为8192HU/mg。【结论】成功获得了金黄色葡萄球菌α-HL,且所获的α-HL具有良好的溶血活性。     

猪整合素αv多克隆抗体制备与应用

利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达,纯化目的蛋白免疫小鼠,制备猪整合素αv多克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后,截取胞外区抗原性较好的基因片段,针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上,诱导表达并纯化重组蛋白,对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价,利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400,且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体,为后续相关研究提供基础。     

胸腺肽αl原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

 构建胸腺肽αl（Thymosin αl,Tαl）基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,为大量获得胸腺肽αl打下基础。将人工合成的Tαl三串体基因插入到表达载体pET32a后,CaC12法转化大肠杆菌BL21,经氨苄青霉素筛选后用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测BL21中胸腺肽αl的表达。大肠杆菌中检测到与目的蛋白相对分子量(31kD)相符的条带。成功构建了Tαl原核表达载体,该蛋白能在大肠杆菌中表达。     

促冻杀虫基因工程菌的构建

 利用转座酶基因位于转座单位以外的微转座子载体,将冰核基因iceA置于转座单位里,构建了携带iceA的自杀性工程质粒pTnice1, 并进一步利用该质粒的接合转移特性和Tn5转座功能,将iceA整合到阴沟肠杆菌染色体DNA上,成功地构建了在无选择压力下冰核基因仍稳定存在并有效表达冰核活性的促冻杀虫基因工程菌Enc1.2022ina。经应用试验证明,用该工程菌饲喂玉米螟幼虫,在饲菌后9 d内,虫体的过冷却点比不饲菌的对照提高10℃左右;在饲菌后第6天,于-5℃和-7℃低温下处理12 h,工程菌处理过的幼虫冻死率     

人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。     

L-赖氨酸高产基因工程菌的构建

赖氨酸的高产菌株已通过经典的诱变法获得,但要再提高这些诱变株的产量就很困难.赖氨酸的生物合成很有规律,它不仅依赖于赖氨酸合成途径中的酶,而且依赖于驱动合成赖氨酸的碳源代谢的酶.为了提高赖氨酸产率,就要求改变碳源的供应,从而控制中间物向赖氨酸合成的转化.二氨基庚二酸合酶基因(dapA)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)是菌体在赖氨酸合成代谢途径中,控制表达二氨基庚二酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的关键基因.我们首先分别克隆这两个基因,并使之处于一定启动子控制下.然后将dapA和ppc重组克隆到同一个载体,并转化赖氨酸发酵菌,从而提高菌体内的酶活,进一步提高赖氨酸发酵产率.     

蛴螬提取物对脉络膜新生血管中趋化因子受体3及其配体嗜酸性粒细胞趋化因子表达的影响

目的 观察蛴螬提取物口服、滴眼两种给药途径对实验眼脉络膜新生血管（Choroidal neovascularization,CNV）组织的趋化因子受体3（chemokine receptor 3,CCR3）及其配体嗜酸性粒细胞趋化因子（eosinophil activated chemotactic factor,Eotaxin）表达的影响。方法 选用8周龄雄性BN大鼠32只,随机数字表法平均分成空白组、模型组、口服组、滴眼组,予以不同干预措施。采用YAG激光建立CNV大鼠模型,于造模后7、28 d行荧光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography,FFA）检查,造模后28 d行免疫组化CCR3及其配体Eotaxin染色及其结果观察分析。结果 FFA检查显示：造模后7 d除空白组外,各组均造模成功;造模后28 d口服组与滴眼液荧光渗漏减少。CCR3及Eotaxin免疫组化结果示：口服组与滴眼组CCR3及Eotaxin含量较模型组减少,差异有统计学意义（P<0.05）;口服组与滴眼组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 蛴螬提取物两种给药途径均可抑制实验性CNV模型中CCR3及其配体Eotaxin的表达,从而抑制实验性CNV的形成。     

ERO1α慢病毒过表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中稳定表达

[目的]构建小鼠ERO1α基因慢病毒过表达载体,并筛选其在RAW264.7细胞中稳定表达。[方法]利用PCR方法扩增ERO1α基因的CDS区并测序;将目的片段亚克隆到慢病毒过表达载体pCD513B-1上,构建pCD513B-ERO1α慢病毒过表达载体;通过病毒包装产生慢病毒并转导RAW264.7细胞;转导后的细胞进行嘌呤霉素抗性筛选,获得稳定表达的细胞;利用RT-qPCR和Western blot方法检测ERO1α的表达效果。[结果]ERO1α慢病毒过表达载体构建成功,病毒滴度为5×10~6～10×10~6 TU/mL;慢病毒成功转导RAW264.7细胞并且稳定高表达。[结论]成功构建ERO1α慢病毒过表达载体,并在RAW264.7细胞中稳定高表达,为进一步研究ERO1α在免疫系统中的功能提供了技术支持。     

草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

新城疫病毒La Sota株F基因重组pGAPZα的构建

根据新城疫病毒(NDV)La Sota株F基因序列和毕赤酵母表达载体pGAPZαA多克隆位点序列,设计并合成3对引物,以RT-PCR技术获得NDV La Sota株融合蛋白(F)基因的F1片段和F2片段。将目的基因和质粒pGAPZαA均以KpnⅠ和XbaⅠ进行酶切,以DNA连接酶进行连接并转化Escherichia coliDH5α,转化子经PCR鉴定和酶切鉴定,结果表明构建的重组质粒中含有目的基因片段。将目的基因片段的测序结果与NDV La Sota株F基因序列比对,长度和核苷酸序列一致。     

新城疫病毒Mukteswar株F基因重组pGAPZα-F的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒Mukteswar株F基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶Kpn I和Xba I对目的基因片段及质粒pCAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化E. coli DH5α.以PCR方法确定Mukteswar F1和Mukteswax F2的阳性重组子均为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1 198 bp、269 bp,与新城疫病毒Mukteswar株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.结果表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2,研究Mukteswar株与基因Ⅶ型毒株之间F蛋白的抗原性差异程度打下基础.     

新疆卡拉库尔羊TNF—α基因的克隆及核苷酸序列分析

根据普通绵羊的碱基序列和相关文献设计引物,用RT—PCR扩增并测定了卡拉库尔羊肿瘤坏死因子一仅基因的cDNA序列。结果表明,TNF-αcDNA序列包含了一个705bp的开放阅读框,通过GenBank中的Blastn序列比较分析,卡拉库尔羊的TNF-α基因与普通绵羊的同源性高达99．86％。这为将来制备卡拉库尔羊TNF-α基因探针及卡拉库尔羊分子免疫学的发展提供了理论依据。     

Tαl螺旋藻培育鲍苗的应用效果研究

在8口23.2 m2的池中,于水温12.5～17.7℃、盐度30的传统养殖模式下,研究饲料中定量添加Tαl螺旋藻喂养鲍苗的培育效果.试验组和对照组分别投放壳长(3.68±0.04)mm和(3.66±0.07)mm,密度(5 755±429)粒·m-2和(5 733±169)粒·m-2的鲍苗,经过133 d的养殖,鲍壳长、成活率、日增长分别达到(15.65±0.19)mm和(15.08±0.63)mm、(93.57±0.68)%和(89.25±2.48)%、(90.04±1.49)μm·d-1和(85.81±4.48)μm·d-1.结果表明:添加Tαl螺旋藻培苗,可显著提高鲍苗培育成活率(P＜0.05),促进鲍苗的生长(P＞0.05);且壳色泽好、规格较整齐.经酶联免疫吸附法(EUSA)检测鲍苗体内的胸腺素α1含量也表明,添加Tαl螺旋藻能明显提高鲍苗体内的胸腺素α1含量(P＜0.05).     

Tαl螺旋藻培育鲍苗的应用效果研究

在8口23.2 m2的池中,于水温12.5～17.7℃、盐度30的传统养殖模式下,研究饲料中定量添加Tαl螺旋藻喂养鲍苗的培育效果.试验组和对照组分别投放壳长(3.68±0.04)mm和(3.66±0.07)mm,密度(5 755±429)粒·m-2和(5 733±169)粒·m-2的鲍苗,经过133 d的养殖,鲍壳长...     

番鸭IFN-α基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法从番鸭肺脏器官中扩增IFN-α基因片段,将扩增产物经胶回收后克隆到pMD18-T 载体上,经PCR和双酶切鉴定为阳性后进行序列测定,并用Lasergene v7.1DNAStar软件对测序结果进行分析.结果表明,所扩增的IFN-α基因编码完整的开放阅读框,基因长度为576 bp,为国内外首次报道.并...