应用Nested—PCR技术检测人工感染绵羊蓝舌病病毒

实验采用６只绵羊分成３组,一组作为对照接种ＢＨＫ２１细胞上清液,另二组分别接种ＢＴＶ１０和中国分离株Ｚ１株,攻毒定期采血提取抗原并提取病毒ＲＮＡ,同时进行琼脂扩散试验、普通ＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ试验。结果在整个攻毒期间,琼脂扩散方法检测不到抗原,普通ＰＣＲ方法只能在攻毒后１２ｄ～１５ｄ测得抗原,而Ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ在攻毒后６ｄ即可测得病毒ＲＮＡ,并且可一直持续到３０ｄ。试验证明,Ｎｅｓｔｅ     

应用Nested—PCR技术检测人工感染绵羊蓝舌病病毒

实验采用6只绵羊分成3组,一组作为对照接种BHK21细胞上清液,另二组分别接种BIV10和中国分离株Z1株,攻毒定期采血提取抗原并提取病毒RNA,同时进行琼脂扩散试验、普通PCR、Nested-PCR试验。结果在整个攻毒期间,琼脂扩散方法检测不到抗原,普通PCR方法只能在攻毒后12d-15d测得抗原,而Nested-PCR在攻毒后6d即可测得病毒RNA,并且可一直持续到30d。试验证明,Nested-PCR方法是高度敏感的检测抗原的方法。在临床上能够较早地检出抗原,这对于及时采取有效措施,控制疾病流行具有积极的意义。     

蓝舌病病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立蓝舌病病毒(BTV)病原学检测方法,本研究以纯化的BTV-1免疫绵羊和兔子,制备高免血清。以绵羊抗BTV血清为捕捉抗体、以兔抗BTV血清和羊抗兔Ig G-HRP为检测抗体建立了检测BTV的抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法。该方法能够特异性检测BTV,对羊痘病毒、赤羽病病毒无交叉反应,与鹿流行性出血热鸡胚样品有微量交叉反应,但样品OD450nm/阴性对照OD450nm低于阴阳性临界值,不影响结果判定;敏感性试验检测结果表明该方法可以检出102.79 TCID50的病毒;批内和批间重复性试验变异系数分别为1.44%~8.46%和2.26%~12.44%;采用该方法与RT-PCR方法对60份鸡胚样品进行检测,阳性符合率为90%。本研究建立的AC-ELISA方法为BTV抗原检测提供了一种快速、实用的技术手段。     

用竞争酶联免疫吸附试验检测蓝舌病病毒抗体的研究

对加拿大动物疾病研究所（ＡＤＲＩ）现行的检测ＢＴＶ群特异性抗体的竞争酶联免疫吸附试验（下称标准程序）进行改良，建立新适合国内实验条件易于推广的试验方法（下称改良程序）对１５份实验感染ＢＴＶ的参照牛血清和３６０份样品牛血清进行比较检测，结果表明改良程序与标准程序特异性和敏感性基本一致。用琼凝胶免疫扩散试验（ＡＧＩＤ）对上述参照血清和样品血清进行检测，表明改良程序与标准程序均较ＡＧＩＤ试验敏感，本研究     

鸡毒支原体PCR检测及特异扩增片断的克隆与测序

根据Ｅ．Ｒ．Ｎascimento等人鸡毒支原体（Ｍycoplasma gallisepricum,ＭＧ）基因文库 分离的种特异性片段fＭＧ－２序列,设计合成一对长２５bp的引物Ｌ１Ｒ１,经ＰＣＲ反 应条伯优化选择,对５株ＭＧＤＮＡ扩增均产生出预期的７３２bp特异扩增片断,而不能扩增滑液支原体（Ｍycoplasma synouiae,ＭＳ）、Ｅ．coli、ＰＵＣ１９质粒ＤＮＡ,符合 设计要求;ＤＩＧ随机引物法标记扩增产物ＤＮＡ探针,与上述菌株ＤＮＡ Ｄot-blot杂交     

多重聚合酶链反应筛选方法的研究

本文提出了筛选多重聚合酶链反应的常用方法，根据该法将56个牛微卫星组成的21个多重聚合酶链反应组合，其中14个三微卫星组合，7个二微卫星组合，这些多重聚合酶链反应组合可用于大批量测定微卫星的试验，如基因定位及亲子鉴定等。     

用PCR检测嗜水气单胞菌毒素基因

选取气单胞菌毒素基因中保守区的同源寡核苷酸序列为引物，用PCR技术检测临床分离的嗜水气单胞菌的毒素基因。扩增产物中均含有明显的预定条带；用AluI和AvaI酶切进一步鉴定，其酶切片段的数量和大小均与设计相吻合，证实样本中带有毒素基因。细菌在鲜血平板上呈现党大的β－溶血圈，用相应的单克隆抗体检测培养上清中的毒素，亦获阳性结果，进一步证实PCR技术检测气单胞菌毒素准确可靠。     

动物源性食品中弓形虫Nested PCR-RFLP分子检测技术的建立

目的为了建立一种快速、特异、灵敏检测动物源性食品中弓形虫的技术。方法根据原虫rDNA的部分序列,找出弓形虫和新孢子虫共同保守DNA片段,设计套式PCR两对引物,以UltraPureTM基因组DNA快速提取试剂盒提取弓形虫和新孢子虫DNA为模板,初步建立了检测两种虫体的Nested PCR技术。将纯化的Nested PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中,经鉴定、测序并进行同源性分析。结果Nested-PCR的外、内引物对两种虫体rDNA基因均能进行扩增,长度分别在800~900 bp、400~500 bp之间。内引物扩增DNA序列与公布的同种虫体DNA序列同源性较高,弓形虫和新孢子虫分别达99.1%、97.2%,但它们两者之间差异较大,同源性仅为86.6%。用软件寻找能区别两者基因序列差异的酶切位点,挑选内切酶进行RFLP实验,结果表明新孢子虫NestedPCR扩增片段能被Vsp1酶切。同时进行该分子检测技术的特异性和敏感性试验,实验证明该Nested PCR能对弓形虫和新孢子虫rDNA基因进行特异性的扩增,而对其它原虫基因未能扩增出任何片段;该Nested-PCR能检测出100个弓形虫速殖子/g猪肉。结论本实验建立Nested PCR检测方法不仅可用于检测动物性食品中弓形虫,而且能明确区分弓形虫和新孢子虫。     

应用PCR-RFLP分析鉴定鸡毒支原体

本试验合成１对引物,对鸡毒支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ,ＭＧ）、滑液支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｙｎｏｖｉａｅ,ＭＳ）１６ＳｒＲＮＡ和２３ＳｒＲＮＡ基因的间隔区序列进行ＰＣＲ扩增,然后分别用ＲｓａⅠ、ＤｒａⅠ对上述扩增产物限制性酶,所获得的片段进行琼脂糖凝胶电泳。     

反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

本研究成功地建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术。根据ＰＲＲＳＶ两个标准毒株（美洲ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株及欧洲ＬＶ株）膜蛋白和核衣壳蛋白的编码序列差异,自行设计合成了各自的引物,对两标准毒株及广州分离株（ＣＤＧ９５１２）进行扩增,获得了预期久为１ｋｂ的扩增片段。酶切鉴定,结果进一步主宰两标准毒株间基因差异显著,分离株与美洲株更为接近,百不同于     

番鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立及应用

通过比对分析GenBank上登录的多株番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（Goose parvovirus）全基因序列,选取两种病毒间相似性较低的区域设计合成了2对特异性引物,建立了能快速鉴别诊断MDPV的套式PCR方法。该法仅能特异地扩增MDPV,敏感性达到62copies／uL,比普通PCR高1000倍。运用该方法对分离的12份临床样品进行检测,结果检测出2份MDPV。本试验所建立的套式PCR方法可用于MDPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

新城疫病毒特异性糖蛋白基因探针的制备及应用

应用ＲＴ－ＰＣＲ获取新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的部分囊膜糖蛋白基因片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为９２６ｂｐ,与预期结果相符;将该基因片段定向克隆入质粒载体ＰＵＣ１９只,得到重组质粒Ｐ９２６,酶切分析结果与已发表的ＮＤＶ毒株酶切位点一致。     

非洲猪瘟病毒多基因家族成员MGF360-12L RPA检测方法的建立

为建立一种简便、快速的针对非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族成员MGF360-12L的分子检测方法,基于MGF360-12L基因序列,设计并合成引物,建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,于35℃恒温反应30 min,即可实现对目的片段的稳定扩增;以含有MGF360-12L基因的重组质粒为模板,RPA反应的检测限达到10~3个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和 PCV-2基因组cDNA或DNA没有扩增。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低,能够为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。     

光生物素标记的口蹄疫病毒cDNA探针的制备及其对口蹄疫病毒RNA检测的试验研究

本文首次报道了利用pF1034质粒制备FMDV O型特异性探针,并通过PCR反应扩增FMDO_1K株病毒基因组的第2962位与3071位之间共110bp序列,制备了能检测O型、A型和亚洲I型FMDV RNA的群(组)特异性探针。用硝酸纤维素膜斑点杂交试验表明,二者均能检测出10pg水平的O_9K毒株的纯RNA;但前者只与O型FMDV RNA杂交,与A型及亚洲I型FMDV RNA无交叉杂交现象;而后者则能与O型、A型和亚洲I型的FMDV RNA发生杂交反应。对照试验显示:此两种探针与SVDV ssRNA、BTV dsRNA、EHDV dsRNA、DHV ssRNA、PRV DNA、乳鼠组织细胞RNA、BHK_(21)克隆13细胞RNA及DNA等均不出现交叉杂交现象,但与IBR DNA有假阳性杂交反应。