苹果MdGA20ox1 基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 以苹果砧木SH40[（Malus × domestica）× M. honanensis]为试材,采用RT-PCR 结合RACE 技术从SH40 茎尖中克隆得到一个赤霉素合成关键酶基因（GA20–氧化酶基因）,命名为MdGA20ox1, 其cDNA 全长1 579 bp,编码392 个氨基酸。该基因在GenBank 登录号为KC493633。氨基酸序列同源性 分析表明：MdGA20ox1 与玉米、拟南芥、梨等植物GA20ox 具有55.9% ~ 96.7%的相似性。洋葱表皮细 胞瞬时表达显示,MdGA20ox1 蛋白定位于细胞核与细胞质膜。植株生长量测定和相对定量表达结果表明, MdGA20ox1 基因在砧木SH28、SH40 和M26 自根苗的表达呈先下降再上升然后下降的趋势,这与其生长 动态基本一致。嘎啦/SH28 的植株生长量和MdGA20ox1 表达量最高,嘎啦/M26 次之,嘎啦/SH40 最低, 初步表明该基因的表达有与苹果植株矮化程度呈负相关的趋势。MdGA20ox1 在嘎啦/SH40 和嘎啦/SH28 不同组织中的表达模式一致,且半矮化类型砧木SH28 嫁接‘嘎啦’,其茎尖、幼叶、成熟叶和枝皮中的 表达量均高于矮化类型SH40 嫁接‘嘎啦’。     

龙眼胚性愈伤组织DlCK2-α基因克隆、亚细胞定位及其表达特性分析

【目的】克隆龙眼DlCK2-α基因,并对其表达特性进行分析。【方法】该试验通过RACE技术对DlCK2-α进行克隆,并在此基础上进行生物信息学分析和亚细胞定位以及蛋白质结构和功能的预测。对调控DlCK2-α的miRNA及顺式作用元件进行预测,并进行亚细胞定位观察。采用QRT-PCR技术对其在龙眼体胚不同阶段胚性培养物和不同光质的表达特性进行研究。【结果】DlCK2-α基因含有开放阅读框1 002 bp,共编码333个氨基酸(GenBank登录号:MG181952);DlCK2-α属亲水性蛋白,不含有信号肽和跨膜结构域,但是含有一个典型的STKc_CK2_alpha保守结构域,预测含有32个磷酸化位点;miRNA预测结果显示,共有miR2615a等10条miRNA可能调控DlCK2-α;顺式作用元件预测显示多个光响应与应激响应元件可能调控DlCK2-α;GFP荧光定位观察显示其定位于细胞质。QRT-PCR结果显示,DlCK2-α在黑暗条件下的表达量高于光处理下的表达量。在体胚不同发育阶段,DlCK2-α在不完全胚性紧实结构中的表达量最低,球形胚中表达量最高,整体呈先降后升趋势。【结论】DlCK2-α基因在龙眼光信号转导和体胚发育调控中发挥重要作用。     

茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

以茶树(Camellia sinensis)‘迎霜’为试验材料,采用同源克隆的方法,利用RACE和RT-PCR技术获得茶树NADPH氧化酶基因Cs RBOHA的c DNA全长(Gen Bank登录号:KJ782632)。该基因全长3 157 bp,开放阅读框2 769 bp,编码922个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为103.33 k D,理论等电点为9.28;C端序列较保守,N端序列保守性较低,与烟草和蓖麻的相似性达79%,进化关系最近;蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上,与预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,该基因的表达存在组织特异性,并且在低温(4℃)、高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、ABA(200 mg·L-1)和干旱(10%PEG 6000)条件下出现不同程度的上调。     

西瓜ClWRKY54基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY转录因子是植物中所特有的一类转录因子,以基因家族形式存在,并在植物的生长发育和逆境响应等过程中发挥重要的作用。采用RT-PCR的方法从西瓜中分离得到一条西瓜CIRKY54基因。序列分析表明,该基因开放阅读框全长1 428 bp,编码475个氨基酸。其编码蛋白分子量约为51.82 KD,等电点为6.17。该基因蛋白序列中包含2个WRKY保守结构域,锌指结构为C2H2型,属于典型的1类WRKY基因。进化树分析显示,该基因蛋白序列同葫芦科作物中的甜瓜、黄瓜、西葫芦等的WRKY26具有较高的同源性,处于同一分支上。亚细胞定位分析显示,该基因编码蛋白定位于细胞核中。对该基因进行荧光定量PCR分析研究其表达特性,结果显示该基因在西瓜根、茎、叶中均有表达,但是在叶片中表达量最高;H_2O_2可以诱导该基因的表达,而乙烯处理可以抑制该基因的表达,这说明该基因可能参与逆境下H_2O_2和乙烯所介导的信号途径。在模拟干旱下,该基因表达无变化,说明该基因同干旱胁迫抗性不相关。本研究的结果将为进一步的解析ClWRKY54的功能奠定基础。     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

茶树低温胁迫转录因子CsICE的亚细胞定位及表达分析

 以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料,采用PCR技术扩增出与茶树低温胁迫相关转录因子CsICE的开放阅读框,长度783 bp。采用荧光定量PCR分析CsICE的表达量,结果表明CsICE在根、茎、叶、花和果中都有表达,在叶中表达量最高,是根、茎、果中表达量的4倍;在500 μmol ? L^-1 ABA处理下,幼叶中CsICE表达峰值是对照的40倍,在4 ℃低温处理下,最高值是对照的20倍,在10%聚乙二醇6000处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的5倍。亚细胞定位结果显示CsICE定位在细胞核上。     

‘秦冠’苹果MdWRKY基因亚细胞定位及原核表达

 以‘秦冠’苹果为试材,采用RT-PCR方法获得了一个WRKY基因,全长1 224 bp,推断其编码331个氨基酸,命名为MdWRKY。亚细胞定位分析MdWRKY蛋白分布在细胞核内,属于核蛋白。实时定量分析结果显示,MdWRKY基因受苹果斑点落叶病菌的诱导,表明其可能参与植物与病原菌的互作。随后进行原核表达分析,SDS/PAGE电泳结果表明表达蛋白与其蛋白大小一致。     

番荔枝节律钟输出基因AsGI的克隆、亚细胞定位与表达分析

GIGANTEA基因在植物开花和生理节律变化过程中起着重要作用。利用同源克隆和RACE-PCR的方法获得番荔枝GIGANTEA基因的全长cDNA序列,命名为AsGI,GenBank登录号为KR095281。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsGI基因长为3 465 bp,编码1 154个氨基酸。氨基酸序列比对显示与葡萄和油棕的GI的相似度分别为77%和76%。构建类似蛋白系统进化树显示,番荔枝AsGI与香蕉、海枣、油棕等分子进化距离较近。预测AsGI蛋白为转录因子,定位在细胞核中,为非分泌性蛋白质,不具备信号肽。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化烟草上表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草上表皮细胞的细胞核中有绿色荧光。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的器官中,AsGI的表达量存在差异,在叶片、花蕾和成熟花中的表达量相对较高。AsGI呈现昼夜节律表达模式,长日照下叶片中AsGI在白昼的表达高于短日照处理。在4月、6月和8月,AsGI的表达量相对较高。该基因可能作为番荔枝花期调控分子育种的目标基因。     

茶树低温胁迫转录因子 CsICE 的亚细胞定位及表达分析

以茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]品种‘迎霜’为试验材料,采用 PCR 技术扩增出与茶树低温胁迫相关转录因子 CsICE 的开放阅读框,长度 783 bp。采用荧光定量 PCR 分析 CsICE 的表达量,结果表明 CsICE 在根、茎、叶、花和果中都有表达,在叶中表达量最高,是根、茎、果中表达量的 4 倍;在 500 μmol L-1ABA 处理下,幼叶中 CsICE 表达峰值是对照的 40 倍,在 4 ℃低温处理下,最高值是对照的 20 倍,在 10%聚乙二醇 6000 处理的干旱条件下表达量最高值只有对照的 5 倍。亚细胞定位结果显示 CsICE 定位在细胞核上。     

苹果MdDRB1的表达与功能分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为试材,扩增Md DRB1基因,分析其序列结构,同时原核诱导Md DRB1蛋白并观察其亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Md DRB1在非生物胁迫下的表达量,通过遗传转化苹果苗鉴定Md DRB1在非生物胁迫中的功能。基因结构分析显示,Md DRB1具有2个内含子和3个外显子。亚细胞定位显示,Md DRB1主要定位于细胞核,少数定位在细胞质。原核诱导结果显示,Md DRB1融合蛋白以包涵体的形式存在。同时发现Md DRB1反义转基因愈伤中与抗性相关的mi RNA的表达水平上调。在PEG、ABA、盐和低温处理的材料中Md DRB1的表达水平明显上调。另外,Md DRB1过量表达明显提高了转基因苹果组培苗的抗性。推测Md DRB1在抗逆胁迫响应中有重要作用。     

苹果细胞质型苹果酸脱氢酶的基因克隆、表达及酶活性分析

 根据亚细胞定位,苹果酸脱氢酶可分为5种类型,其中依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶（cyMDH）在植物上的研究较少。从苹果果实中分离了cyMDH的全长cDNA序列, 命名为Mal-cyMDH（Genebank登录号为DQ221207）,该序列含有一个996 bp的ORF。序列同源性分析表明Mal-cyMDH与其他物种cyMDH有较高的同源性,进化树分析表明几乎所有的cyMDH可以聚类在一个分支上,并且cyMDH可能是MDH的最原始种。原核表达得到一个37 kD左右的融合蛋白,酶活测定表明该酶主要催化合成苹果酸。苹果果实中cyMDH酶活分析表明在高酸和低酸基因型中该酶的还原活性存在明显差异。     

三倍体枇杷花期调控基因Ej SPL5的克隆、亚细胞定位及表达分析

利用同源克隆和c DNA末端快速扩增(RACE)技术从三倍体枇杷‘Q27’中分离得到1个调控花期的SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL)转录因子家族基因EjSPL5。该基因cDNA序列全长为778 bp,其中5′非翻译区(UTR)序列为24 bp,3′UTR序列为214 bp,包含1个长为549bp的开放阅读框(ORF),编码182个氨基酸。蛋白序列比对分析表明,EjSPL5和苹果、拟南芥及金鱼草的SPL蛋白序列具有较高的相似性,均具有保守的SBP结构域和核定位信号(NLS)。分子系统进化分析表明,EjSPL5与苹果MdSPL5具有较高的同源性,聚为同一分支。EjSPL5的亚细胞定位发现,其行使功能区域定位在细胞核。实时荧光定量PCR分析表明,EjSPL5在枇杷萼片和幼果中的表达量较高;二倍体和三倍体枇杷的早、晚花品种中EjSPL5表达量存在显著差异,其表达主要集中在花发育的前6个时期,在花蕾露白期和盛花期的表达量较低。三倍体枇杷EjSPL5表达量在花芽形态分化期最高,二倍体枇杷在花序侧生支轴快速伸长期的表达量最高。早花枇杷品种的EjSPL...     

香蕉MYB基因克隆和表达分析

【目的】获得香蕉抗逆相关转录因子。【方法】通过随机克隆测序的方法从香蕉根系c DNA文库中获得MYB基因,命名为Ma MYB1。【结果】对扩增获得的c DNA序列进行生物信息学分析,表明Ma MYB1是香蕉MYB基因编码框全长c DNA,包含一个951 bp的最大开放阅读框,编码一个长316个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的2个保守的MYB结构域R2和R3,属于典型的R2R3-MYB基因。系统进化树比对分析表明,Ma MYB1与海枣(XP_008808341.1)和油棕(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明该基因在叶、根和花中的表达量较高。实时荧光定量PCR分析表明Ma MYB1响应干旱、低温、盐和枯萎病菌的侵染等胁迫处理。【结论】Ma MYB1基因在香蕉响应逆境中扮演重要的调控角色。     

银杏GbERF1转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

ERF是植物中一类重要的转录因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的响应。以3年生银杏苗为试材,采用RT-PCR与RACE-PCR方法,研究了银杏ERF基因序列,以期深入了解银杏药用成分合成代谢的分子机理。结果表明:GbERF1含有长度为1 314bp的完整开放阅读框,编码437个氨基酸。蛋白序列分析显示,GbERF1蛋白含有2段ERF家族的特殊位点。GbERF1蛋白序列与北美云杉(ADE75663.1)序列的相似性为97%。系统进化树分析,GbERF1与北美云杉、狭叶羽扇豆的序列可划归为同一分支。实时荧光定量PCR结果显示,GbERF1主要在银杏根和叶中表达,逆境胁迫处理后显示,该基因在乙烯、紫外诱导处理下,表达量大幅度提升,随后下降,但仍高于对照组,干旱诱导处理下表达量先升高后降低,矮壮素(CCC)诱导下表达量变化不太明显。烟草叶片下表皮细胞亚细胞定位结果表明GbERF1定位于细胞核。     

葡萄E3泛素酶HOS1基因克隆、表达及抗血清制备

HOS1(High expression of osmotically responsive genes 1)编码 1 个具有 E3泛素连接酶活性的蛋白,是模式植物拟南芥冷反应信号转导途径的关键负调控因子,但其在多年生葡萄属植物中参与低温胁迫应答的分子机制尚不明确.以欧洲酿酒葡萄品种'霞多丽'的叶片为供试材料,克隆了V...     

炭疽菌诱导的枇杷病程相关基因EjPR1的克隆及其表达分析

以炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)处理的枇杷高抗品种'Peluches'的叶片为材料,利用RT-PCR和RACE克隆技术,获得枇杷病程相关蛋白1基因的cDNA全长序列,命名为EjPR1.该基因全长为731bp(GenBank登录号为MN92775),5'端非编码区79bp,3...     

番茄转录因子基因SlWRKY16的克隆及原核表达分析

从栽培番茄(Solanumlycopersicum)‘M82’中克隆到1个WRKY家族基因SlWRKY16。研究结果显示:SlWRKY16包含1 497 bp的完整开放读码框,编码498个氨基酸,理论分子量为55.5 kD,含有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于Ⅱb类WRKY转录因子基因,且定位于细胞膜上;栽培番茄Sl WRKY16与潘那利番茄Sp WRKY6(XP₀15064265.1)、马铃薯St WRKY6(XP₀06350473.1)同源性最高。qRT-PCR结果显示SlWRKY16在番茄不同组织中均有表达,叶片中的表达量最高;短时间非生物胁迫下该基因的表达量显著降低。此外,重组菌pET-30a-SlWRKY16在NaCl、甘露醇胁迫下生长均明显低于对照菌pET-30a。综上,番茄SlWRKY16基因可能在响应非生物胁迫过程中具有负调控效应。     

查耳酮异构酶在葡萄果实发育过程中的表达及亚细胞定位研究

以‘赤霞珠’葡萄果实为材料,利用制备好的葡萄查耳酮异构酶(CHI;EC 5.5.1.6)CHI多克隆抗体,采用RT-PCR、蛋白质印记杂交和胶体金免疫电镜技术对葡萄果实发育过程中CHI基因、蛋白表达及亚细胞定位进行了研究。结果表明:CHI基因和蛋白的表达随着果实发育有着明显的变化,在果实发育早期和转色期表达量较高,同果实中总类黄酮含量的积累变化一致;胶体金免疫定位显示在果实发育早期CHI主要分布于葡萄果皮细胞的细胞质中,在液泡及质体中也有少量分布;在转色期主要定位于细胞质、质体和细胞核中,其数量明显增多。在成熟果实中,主要存在于细胞质,少量存在于质体和液泡中。     

多年生黑麦草P5CS基因的cDNA克隆、表达及亚细胞定位

以多年生黑麦草(Lolium perenne)‘Derby'为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶基因(P5CS)的cDNA序列,全长2528bp,推断其编码716个氨基酸,命名为LpP5CS。序列分析表明:LpP5CS基因与小麦TaP5CS和水稻OsP5CS基因核苷酸序列的相似性分别为92.05%和85.82%,氨基酸序列的相似性分别为93.99%和87.99%。半定量PCR结果表明,LpP5CS基因在多年生黑麦草根、茎,叶均有表达。盐处理下,表达量高于对照,其中叶片中表达量最高,根中最低。200mmol·L-1NaCl处理下,LpP5CS基因表达量随处理时间延长,有先升高后降低的趋势。洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达显示,LpP5CS蛋白定位于细胞膜和细胞核。     

豆梨NAC转录因子基因PcNAC1的克隆、亚细胞定位及功能初探

根据豆梨(Pyrus calleryana Dence)接种黑斑病菌后的转录组测序结果,筛选出一个上调表达的NAC转录因子基因。从豆梨中获得了该基因的全长片段,并将其命名为PcNAC1。该基因的开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。将PcNAC1蛋白序列与其他物种蛋白序列进行对比,并构建系统进化树后发现,其与小麦TaNAC4及拟南芥ATAF1具有较高同源性。通过实时荧光定量分析PcNAC1在豆梨不同组中的表达发现,PcNAC1在茎、叶和根中表达量较高,在花和果中表达量较低。构建了亚细胞定位载体,瞬时侵染本氏烟,通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞内的分布情况,发现该基因行使功能的主要区域定位在细胞核。进一步在本氏烟中瞬时表达PcNAC1,接种烟草疫霉病菌后发现PcNAC1可以通过调控植物激素通路防卫反应基因的表达来增强植物的抗病性。