棉花转录因子GhWRKY4基因的克隆及特征分析

 本研究从陆地棉中克隆得到GhWRKY4基因,全长cDNA是1281 bp,包含1083 bp的开放阅读框,编码的360个氨基酸属于IIcWRKY转录因子家族。分析GhWRKY4基因结构表明其有三个外显子和两个内含子。GhWRKY4蛋白的亚细胞定位实验表明其定位在洋葱表皮细胞核。实时荧光定量分析结果显示GhWRKY4在棉花的根、茎、叶和花中均有表达。染色体步移得到了GhWRKY4的5’端侧翼序列,生物信息学软件预测表明GhWRKY4包含一系列和胁迫基因调控相关的反式作用元件,表明GhWRKY4参与植物对盐害和冷害胁迫的反应。     

1个新棉花bHLH类基因GhbHLH130的克隆及表达分析

近年来,已发现碱性/螺旋-环-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix,bHLH)类转录因子家族在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究通过电子克隆方法得到1个新的棉花bHLH类转录因子基因的全长序列,利用反转录-PCR技术从陆地棉中分离出1个bHLH类转录因子基因,并命名为GhbHLH130。该基因包含1个552 bp的开放阅读框,编码184个氨基酸残基。序列分析表明GhbHLH130蛋白包含1个螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix)保守结构域,属于bHLH转录因子家族。实时荧光定量分析结果表明GhbHLH130基因的表达受干旱、高盐、低温以及外源脱落酸的显著诱导。亚细胞定位结果表明GhbHLH130基因在细胞核内表达。本研究结果表明GhbHLH130基因可能作为调控基因参与棉花的逆境应答响应过程。     

条锈菌诱导的小麦bZIP转录因子基因的克隆及表达分析

采用电子克隆和RT-PCR方法,从条锈菌诱导的小麦品种水源11的cDNA中分离到一个编码bZIP转录因子基因的cDNA序列,暂被命名为TabZIP。TabZIP包含一个完整的1 071 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域;与水稻、玉米、拟南芥等植物bZIP蛋白的氨基酸序列相似性较高;TabZIP基因在小麦根中的表达量丰富,而在茎和叶中表达量很小;在小麦与条锈菌非亲和组合中,TabZIP基因高水平表达,而在亲和组合中没有明显的变化;防卫相关激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因的快速上调表达,表明TabZIP可能通过乙烯、茉莉酸信号途径介导小麦对条锈病的防御反应。     

陆地棉转录因子GhNAC78基因的特征及功能分析

本实验室从陆地棉中克隆得到GhNAC78,分析了其基因特征及功能。该基因cDNA全长为937 bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸,隶属于NAM转录因子亚家族。体外转录激活实验表明,GhNAC78具有转录激活活性。上游启动子区1537 bp序列的生物信息学分析可知其包含多种激素、胁迫和光响应元件,表明GhNAC78广泛地参与植物生长发育和胁迫响应的调控。荧光定量结果显示,GhNAC78在棉花叶片衰老过程中高调表达,推测其参与叶片衰老的调控。     

一个陆地棉类烯醇酶基因的克隆及其表达分析

 采用改良的CTAB法提取陆地棉总RNA,运用RT-PCR技术首次克隆了陆地棉类烯醇酶基因的CDS序列,该基因已经在GenBank上登录,登录号为 EU169604,其开放阅读框为1338 bp,编码445个氨基酸残基。对其序列和进化分析表明,陆地棉烯醇酶基因与其它植物中的烯醇酶基因有较高的相似性,该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示该基因在陆地棉的叶、根、茎中均有表达,但在根中的表达量高于叶和茎。     

棉花ADP-ribosylation factor基因(GhARF1)的克隆与表达分析

ADP-ribosylation factor (ARF)是GTP结合蛋白,属于小G蛋白超家族中的ARF亚家族成员,在高尔基体小囊泡形成以及细胞信号传导中起重要作用。棉花纤维的发育需要有高尔基体参与,但ARF基因在棉花纤维发育中的功能尚不清楚。本文利用GHA27作探针,筛选棉花花药的cDNA文库,得到两个序列相同的阳性克隆。核苷酸序列分析表明该基因编码一个有181个氨基酸残基,分子量约20.7 kDa的蛋白,与动物、酵母及其他植物的ARF基因有很高的相似性,命名为GhARF1。采用PCR技术获得该基因序列,该基因含有5个外显子和4个内含子。进化树分析表明该基因更接近人类的classⅠ类ARF基因,在编码的氨基酸序列中具有保守的GTP结合区域,即P（GLDAAGKT）、G（NKQD）以及G’（DVGGQ）。Northern杂交结果显示GhARF1基因在棉花的纤维、花冠和根中表达量较高,特别是在纤维中的表达量最高,在茎、花蕾中也有表达,而在真叶、子叶和胚珠中的表达较微弱。Southern杂交分析表明,ARF基因在二倍体草棉和四倍体陆地棉基因组中均以多拷贝存在。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

棉花TCP家族转录因子基因GhTCP1的克隆与表达分析

通过比对拟南芥、金鱼草、水稻和玉米等植物中已知TCP家族转录因子的氨基酸序列,根据保守区设计兼并引物,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种新陆早13号的DNA为模板,获得棉花转录因子基因GhTCP1的中间保守区序列。根据该段序列设计特异性引物,采用5'和3'RACE技术获得了全长cDNA序列,编码397个氨基酸。基因组DNA序列分析表明,GhTCP1基因含有一个内含子。棉花GhTCP1蛋白与其它植物中的TCP家族转录因子有较高的相似性,证明该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示,该基因在棉花的侧芽中特异表达。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

玉米A亚族bZIP转录因子基因ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)蛋白是真核生物所特有的一类转录因子,对于植物在逆境下的基因表达调控具有重要作用。为丰富对玉米bZIP转录因子功能的认识,本研究以从玉米中克隆到的一个A亚族bZIP转录因子编码基因ZmbZIP81为对象展开。ZmbZIP81基因位于玉米第6染色体,编码区全长2492 bp,由4个外显子和3个内含子组成,编码蛋白含254个氨基酸。研究表明ZmbZIP81基因表达受外源ABA、NaCl和干旱胁迫诱导。过表达该基因的拟南芥植物表现出ABA不敏感和NaCl胁迫抗性增强的表型,推测ZmbZIP81可能作为ABA信号途径的负调控因子参与植物抗逆基因表达调控网络。     

陆地棉NAC转录因子基因GhNAC6的克隆、表达和耐盐性分析

【目的】NAC(NAM-ATAF-CUC)家族是植物细胞内特有的1类转录因子家族,参与植物的抗逆过程。为了研究棉花抗逆的分子机制,本研究从陆地棉TM-1中克隆到1个NAC转录因子基因并研究了其功能。【方法】根据其序列同源性和进化分析结果,将该基因命名为GhNAC6,本文对GhNAC6进行了生物信息学和表达分析,并利用病毒诱导基因沉默技术在棉花中沉默GhNAC6的表达。【结果】GhNAC6全长为1629 bp,包含2个内含子,其中编码区为900 bp,编码1个相对分子质量为33.9×10~3、等电点为6.18的蛋白。GhNAC6启动子区段包含多个与诱导表达和组织特异表达相关的顺式作用元件。转录组数据分析结果表明,GhNAC6在棉花发育的不同时期具有时空表达差异性;实时荧光定量核酸扩增检测结果显示GhNAC6还受到植物激素水杨酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和逆境胁迫低温、高温、高盐、伤口的诱导。干涉GhNAC6基因发现,降低GhNAC6基因的表达能增强棉花对盐胁迫的耐受性。【结论】研究结果表明GhNAC6可能参与了棉花发育、逆境响应和激素信号传导的过程。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhRop4的克隆及其表达分析

【目的】对陆地棉小GTP结合蛋白基因(Small GTP-binding protein)GhRop4(AY965614.1)在多种逆境胁迫下的应答表达模式进行研究分析,为棉花抗逆相关基因克隆及棉花抗逆分子机制研究奠定基础。【方法】利用生物信息学方法分析了GhRop4基因的结构特征和进化树关系,并通过荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法分析Gh Rop4基因的组织表达特异性和不同逆境诱导条件下的表达模式。【结果】以陆地棉c DNA为模板克隆得到GhRop4基因,其开放阅读框为588 bp,编码包含195个氨基酸残基的Ⅰ型Rop蛋白。氨基酸多重序列比对表明,GhRop4与其它植物Rop蛋白高度同源,符合Rop蛋白结构特点。qRT-PCR分析表明,GhRop4基因在棉花幼苗根、茎、叶、子叶和下胚轴中均有表达,且在子叶和茎中表达水平较高。GhRop4基因对高盐、干旱、低温和棉花黄萎病菌处理都有一定程度的响应。【结论】Gh Rop4基因在陆地棉的逆境胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

茶树bZIP转录因子基因CsbZIP1的克隆与表达定位

碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子,参与多种生物学过程,尤其在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技术克隆到茶树bZIP转录因子基因全长cDNA序列,命名为CsbZIP1(GenBank登录号为JX050148.1)。该基因cDNA全长1515 bp,包含813 bp的完整开放阅读框(ORF),编码270个氨基酸,预测分子量29.484 kD;含有bZIP家族典型的BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B_-zip1家族;系统发育树分析显示CsbZIP1属于bZIP转录因子F亚家族;亚细胞定位结果表明CsbZIP1主要定位于细胞核;qRT-PCR分析表明,4℃低温和NaCl盐胁迫处理均能诱导CsbZIP1的表达,表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高,到24 h时降低,ABA胁迫处理24 h抑制CsbZIP1的表达。推测CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。     

棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析

 以棉花EST序列分析为基础,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花中克隆了2个新的F box蛋白基因,分别命名为GhFB1 (GenBank核酸数据库登录号：EF419428)和GhFB2 (GenBank登录号：EF503623)。GhFB1cDNA全长866bp,编码162个氨基酸;GhFB2 cDNA全长657bp,编码161个氨基酸,而且两者均含有植物F-box蛋白家族特有的F-box结构域。序列比较分析表明,GhFB1和GhFB2蛋白与水稻OsGID2,拟南芥AtSLY1具有高同源性,是棉花中F-box蛋白家族的新成员。RT-PCR结果表明,GhFB1和GhFB2在根、下胚轴、叶、茎、花和纤维中都有表达,而且均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测这2个基因在棉纤维早期发育中可能起重要作用。     

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一, 参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) D₅基因组数据库以AtMYB0 (GL1, NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0, 从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0, 其开放阅读框长度为843 bp, 编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明, GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达, 开花后20 d表达量达高峰; 在所有的组织器官中, 花中表达量最高, 其次为胚珠。转基因功能分析结果表明, 在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0, 使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少; 该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达, 能恢复表皮毛缺失型突变体的表型, 说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用, 本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。     

陆地棉开花相关基因GhFLP1的克隆与功能验证

为了明确陆地棉开花促进因子基因的作用,以中棉所36叶片基因组DNA和cDNA为材料克隆得到了开花相关基因Gh FLP1,分析了其特征及功能。该基因全长为537 bp,包含339 bp开放阅读框,编码112个氨基酸。预测分子量约为12.176 kDa,理论等电点为9.13。组织特异性表达分析表明,该基因在花蕾中优势表达,且在早熟品种(中棉所36、中棉所74)中表达量高于中熟品种(中棉所60、鲁棉研28)。启动子序列分析和外源激素处理实验表明该基因受水杨酸和赤霉素调控。农杆菌介导转化拟南芥发现,该基因能促使拟南芥莲座叶减少,开花期提前。荧光定量结果表明,在转基因拟南芥中,内源开花相关基因AtFT、AtLFY、AtAP1和AtSOC1表达量不同程度上调,AtFUL表达量基本不变,AtFLC表达量下调。研究结果显示该基因可能参与陆地棉开花时间的调控,为创制转基因早熟棉花新材料打下基础。     

小麦转录因子TaMyb2s的克隆及表达

利用小麦TaMyb2基因特异引物, 克隆了3种类型TaMyb2的cDNA序列, 分别命名为TaMyb2-I、TaMyb2-II和TaMyb2-III。氨基酸序列比对结果表明, TaMyb2s的序列高度相似。系统进化树分析显示, TaMyb2s与来自大麦、水稻等的直系同源基因编码蛋白的亲缘关系较近; TaMyb2s的3种类型与小麦基因组没有明显的对应关系。实时定量PCR检测结果表明, 小麦幼苗中的TaMyb2s均参与对渗透胁迫的应答反应, 但表达模式不尽相同, TaMyb2-III对渗透胁迫的应答最迅速, TaMyb2-I次之, TaMyb2-II最迟缓。从小麦不同发育时期幼嫩组织中TaMyb2s的表达情况推测, TaMyb2-I和TaMyb2-III可能主要在生长发育的前期调控下游基因, 而TaMyb2-II主要在发育后期发挥作用。