柞蚕核型多角体病毒侵染对柞蚕幼虫体内部分保护酶活性的影响

研究柞蚕幼虫被柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)侵染后,体内主要保护酶活性的变化,有利于了解Ap NPV对柞蚕的致病机制。测定柞蚕4龄幼虫被Ap NPV侵染后血淋巴中几种保护酶的活性,结果表明:柞蚕幼虫被Ap NPV侵染后,其血淋巴中的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性逐渐升高,分别在接种后第4和第3天达到最大值0.11 U/(m L·min)、573.97 U/(m L·min),之后又逐渐下降;血淋巴中的过氧化氢酶(CAT)活性则表现出降低-升高-降低的变化趋势,在接种后第5天达到峰值378.44 U/(m L·min)。在柞蚕对Ap NPV侵染的免疫防御过程中,POD、SOD是首先作出应答反应的保护酶,CAT是在前二者之后起作用的保护酶,并且试验组柞蚕幼虫血淋巴中的POD活性始终高于发育同期的对照组幼虫,故推测POD是起主要作用的保护酶。     

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。     

家蚕中肠型脓病的发生规律及防治技术

1家蚕中肠型脓病的病原 家蚕中肠型脓病，又叫家蚕质型多角体病毒病，其病原为家蚕质型多角体病毒（Bombyxmori Cytoplasmic Polyhedrosis，BmCPV）。该病原属于呼肠弧病毒科（Reoviridae）质型多角体病毒属（Cy．povirus），主要寄生于家蚕中肠上皮圆筒状细胞的细胞核内（图1）。家蚕质型多角体病毒以游离态病毒粒子和多角体2种形式存在于病变细胞中：     

美国白蛾核型多角体病毒感染柞蚕、家蚕及日污灯蛾等试验

<正> 美国白蛾(Hyphantria cunea Drury.)核型多角体病毒,由丹东动植物检疫所与笔者先后在丹东地区采到,经室内、外试验证明,对美国白蛾幼虫有较强的致病性。了解美国白蛾核型多角体病毒(NPV)能否感染柞蚕与家蚕,这对病毒在蚕业上应用,促进蚕业生产的发展有着密切关系。国外用NPV感染家蚕的试验已有报道。我们侧重作了NPV感染柞蚕与日污灯蛾(Spilarctia japonensis)幼虫的试验。现将试验结果整理如下:     

BmCPV病毒增殖的组织病理研究

本研究采用石蜡切片技术,取健康的三龄起蚕经口接种BmCPV后不同时间段取中肠后部固定、制片,光学显微镜下观察家蚕中肠圆筒形细胞组织变化,作者认为随病毒的入侵复制增殖,病蚕圆筒形细胞出现的病理变化是与病毒复制增殖、多角体形成相关的,细胞内出现浅染小空白点时正是病毒发生基质与病毒粒子大量产生阶段;细胞松弛、先端膨大变形、出现多空泡时正是多角体逐步增多时期。’结合电子显微镜的研究结果,光镜下观察的组织病变进一步说明病毒的复制和多角体的形成都是由细胞顶端部位开始,逐渐向基底部推进,最后新的多角体充满整个细胞,使细胞溃烂破裂,大量多角体和病毒粒子落到肠腔。     

用核型多角体病毒防治舞毒蛾的研究

用舞毒蛾病虫尸稀释液于室内感染其一龄幼虫,半致死浓度(LC_(50))为89个多角体/毫升;感二龄幼虫,LC_(50)为560个多角体/毫升。经二年蚕场防虫试验,以含82—320万多角体/毫升虫尸液防治1—3龄幼虫,效果达81—98％。用虫尸稀释液行小区感染一龄柞蚕及野外蚕场喷毒感染一、二龄柞蚕试验,病毒浓度从56—87,000个多角体/毫升,对柞蚕未见致病性。     

家蚕病毒的特性和对蚕的侵染

<正> 在现有100万种昆虫中,已知感染病毒的昆虫达800多种,其中以鳞翅目昆虫所占比重最大。家蚕病毒现在发现的有核型多角体病毒(NPV)、质型多角体病毒(CPV)、传染性软化病毒(IFV)和浓核病毒(DNV)。由于病毒的特异性,侵染蚕体的组织细胞是不同的(图1)。     

家蚕细胞质多角体病毒核型变异系的研究进展

<正> 家蚕细胞质多角体病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)质型多角体病毒群(Cypovirus)。感染家蚕后,能在中肠圆筒形细胞的细胞质中形成多角体,这种蚕病就叫家蚕细胞质多角体病。1967年田中等发现一种寄生于中肠圆筒形细胞核中的大型多角体,其患病蚕中肠混浊、褐色、不象细胞质多角体病那样中肠呈乳白色。当时命名为中肠     

不同温度对柞蚕核型多角体病毒在樗蚕蛹精细胞系中增殖的影响

本试验用柞蚕核型多角体病毒（Antheraea Pemyi Polyhedrosis Virus简称ApNPV）感染樗蚕蛹精巢细胞系,分别置于0℃,4℃,15℃,20℃,26℃,28℃,30℃,37℃下静止培养,观察细胞病理变化,测定细胞的感染百分率和多角体含量。试验结果表明,不同温度对病毒的感染率及其在细胞中复制有明显的影响。26℃～28℃是柞蚕核型多角体病毒感染樗蚕蛹精巢细胞并形成多角体的最适培养温度,感染率最高,多角体含量也最多。培养温度过低或过高,多角体都不能在细胞内复制。     

家蚕5龄幼虫后期核型多角体病毒的增殖/永田昌男等/日蚕杂,

在家蚕5龄幼虫各个时期注射核型多角体病毒(NPV)后,对幼虫血液中病毒浓度进行免疫法检测。通过对病毒增殖曲线的比较后发现,幼虫期病毒的增殖率在对数生长期几乎是恒定不变的,仅在病毒增殖的起始阶段有一些差异。虽然感染了NPV病毒的家蚕幼虫最后都会全部死亡,但感染后7天内的幼虫死亡率是随其时期不同而变化的。在     

柞蚕卵巢细胞原代培养及对核型多角体病毒的敏感性

对柞蚕卵巢细胞采用原代培养法,经6—7天形成细胞单层。对培养2周以上的细胞单层,进行柞蚕核型多角体病毒的感染试验,经2—3天可见部分细胞核内形成多角体,约半月感染率达60％左右。     

家蚕质型多角体病毒苏州核包涵体小种的纯化

从BmCPV_t内发现和分离出一株新的核包涵体小种,初步命名为家蚕质型多角体病毒—苏州核包涵体小种(Cytoplasmic Polyhedrosis Virus——Suzhou nuclear polyhedra forming strain,简称CPV——Suzhou N strain),家蚕感梁CPV——Suzhou N Strain引起的多角体病,与国内外已知的CPV各变异株不同。本病蚕的多角体只在中肠组织圆筒形细胞核内检出,多角体内有许多病毒粒子,病毒粒子球状,具有核蛋白紫外吸收特征性光谱和较强的感染活性,病毒核酸初步鉴定为dsRNA。     

家蚕四角形质型多角体病毒的研究

运用生物实验、组织切片、电镜显微技术研究了家蚕六角形野生株(GCPVh)和四角形变异株(GCPVt)质型多角体病毒对家蚕的致病力、感染组织细胞病变、多角体超薄结构。初步表明:GCPVt比GCPVh对蚕致病力强、感染后的中肠细胞病变有差异,同时观察到多角体超微结构在病毒粒子的包埋状态、多角体蛋白的电子密度等方面也存在着一定的差异。     

蓖麻蚕核多角体病毒的研究及其预防试验

感染核多角体病毒后的蓖麻蚕,逐渐表现发育迟缓,体背及两侧出现很多大小不一的黑点(斑),甚至头壳及胸足都变为棕褐色,食欲减退,静伏少动,时见口吐胃液、拉稀或排念珠状粪等病征,从感病至死亡约需6～9天。病毒多角体一般为三角形,也有四角形或不规则形,其大小约为1.7～2.8微米,经生物测定其致死中浓度(LC_(50))为1×10~7个多角体/ml。病毒粒子呈杆状,直径约为60nm,长度约为344nm。取病蚕组织固定,用石蜡包埋切片、染色镜检及电镜观察,可见在脂肪、气管、皮肤、丝腺等组织细胞核内形成大量的多角体。病毒粒子首先侵入中肠上皮细胞,在圆筒细胞核内复制增殖后,再侵入体腔内各种组织,最初在细胞核内出现电子密度高、呈网状构造的病毒发生基质,继而出现零散的病毒粒子,至病毒粒子整齐排列,散开外面包膜,然后埋入多角体蛋白质中,不断成长变为成熟的多角体。对广东现行蓖麻蚕品种进行抗病毒病的测定试验,结果以广四品种抗性较强,其次为高州1号、广花黄、广白黄。根据病毒干扰原理,1～3龄起蚕添食灭活多角体,再以活性病毒多角体感染,结茧率仍有40～60％。各龄起蚕若以10％石灰清液添食,3龄后用活性病毒多角体感染,结茧率仍可达50～73.3％。以上试验证明,均有一定的抗病毒感染作用,可供生产上参考、应用。     

家蚕中肠细胞与家蚕核型多角体病毒经口感染因子P74的互作蛋白筛选

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)包涵体衍生型病毒粒子(ODV)被家蚕幼虫食下后通过侵染中肠上皮细胞引发全身性感染,这个过程称为经口感染。已知有多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,被称为经口感染因子(PIF)。P74作为最早被鉴定的PIF,与ODV结合中肠上皮细胞有关。为了鉴定宿主家蚕中肠细胞中与P74互作的蛋白质,构建家蚕中肠酵母文库,并以P74作为诱饵进行酵母双杂交筛选。初步筛选到7种互作候选蛋白,分别为U3小核仁核糖核蛋白IMP3、60S核糖体蛋白L5、JAB-MPN结构域蛋白、细胞质肌动蛋白A3、35 k D蛋白酶、富半胱氨酸和组氨酸蛋白1-B和真核翻译起始因子1A。免疫共沉淀实验结果表明JAB-MPN结构域蛋白和P74之间存在强烈互作,该蛋白质可能是ODV结合中肠细胞的关键宿主因子。研究结果为进一步阐明Bm NPV经口感染的详细分子机制提供了新的线索。     

蓖麻蚕(木薯蚕)病的种类与识别(续六)

核多角体病是蓖麻蚕的一种主要病害。蚕儿食下病毒多角体后,在中肠碱性胃液的作用下,多角体溶解,释放出病毒粒子。这些病毒粒子首先在中肠上皮细胞内进行复制,进而侵入血细胞、脂肪细胞及真皮细胞,生殖腺膜细胞也有寄生。病重时,丝腺、神经细胞都有多角体形成。 蓖麻蚕核多角体病仅能水平传播,食下传染是本病的主要传染途径。感染病毒后,小蚕期经过3～4天,大蚕期经过5～7天发病死亡,死后蚕体变软。染病的蚕儿,食欲减退,发育迟缓,出现较多的小蚕、迟眠蚕、半蜕皮或不蜕皮蚕。蚕儿狂躁外爬,蚕体环节肿胀,节间膜发亮。重病蚕,背部及两侧气门处…     

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef-11基因在病毒感染宿主细胞中的表达特征

杆状病毒晚期表达因子(late expression factor,LEF)是参与病毒基因组DNA复制和病毒基因转录调控的一个重要家族,该家族成员LEF-11为13 k D的小分子蛋白质。通过比对目前已经测序的63种杆状病毒基因组序列,发现LEF-11的编码基因lef-11在除宿主为双翅目昆虫的Cuni NPV外的所有杆状病毒基因组中都存在,暗示lef-11基因可能在包括家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)在内的杆状病毒复制过程中行使重要功能。通过RT-PCR检测和Western blotting分析lef-11基因及其编码蛋白质在Bm NPV侵染的家蚕卵巢培养细胞Bm N中的转录与表达时相,其转录本从侵染后6h开始持续表达,蛋白质从侵染后12 h开始持续表达。当利用DNA聚合酶特异抑制剂阿非迪霉素(aphidicolin)阻断Bm NPV病毒基因组DNA复制之后检测LEF-11的表达受到抑制,暗示LEF-11的表达起始于病毒DNA复制之后。以上结果表明:BmNPV lef-11基因在杆状病毒中非常保守,是一个晚期表达基因,可能不直接参与病毒的起始复制,而是参与病毒的大规模复制过程。     

柞蚕核型多角体病毒实时荧光LAMP检测方法的初步建立

柞蚕脓病是柞蚕生产上的主要病害之一,病原为柞蚕核型多角体病毒(Ap NPV)。建立快速而准确检测蚕体样品中Ap NPV的技术,将有助于对病害的早期诊断及流行病学调查和实施有效的防控措施。以柞蚕核型多角体病毒ORF142基因为靶基因,设计2组特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,利用实时荧光PCR技术进行检测分析。结果表明,设计与合成的2组引物均能对柞蚕核型多角体病毒基因组扩增出特异性产物,其中引物组2在63℃开始孵育60 min,反应起始扩增时间为12 min,当反应时间达到40 min时,扩增曲线的最大相对荧光强度(RFU)值达6 000,相对于引物组1具有更好的及时性,可缩短一半反应起始时间。初步建立的Ap NPV实时荧光LAMP检测方法相对于传统PCR方法,检测效率提高4倍左右。     

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

家蚕核型多角体病毒对两广二号和桂蚕N2创伤感染的差异性分析

以桑蚕抗性品种桂蚕N2和常规品种两广二号为对象,用昆虫针在蚕体表制造创口接种新采集的核型多角体病毒(Bm NPV),研究它们感染Bm NPV的差异。结果显示两广二号的Bm NPV创伤感染半数致死浓度(LC_(50))为2.46×10~6 PDV/m L,相当于脓病末期蚕血液稀释264倍的值,属于易感品种。而同等条件下桂蚕N2的LC_(50)为2.21×108PDV/m L,相当于稀释不到3倍的值,对核型多角体病毒耐受度显著高于前者,具有很强的抗核型多角体病毒创伤感染的能力。饲养桂蚕N2能显著减少蚕期创伤感染Bm NPV的几率。