O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法的建立

本研究建立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法,确立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法检测O型口蹄疫血清阴阳性判定标准：抗体效价大于或等于1：32时判为O型口蹄疫抗体阳性;1：16～1：32时判为O型口蹄疫抗体可疑。检测131份阴性血清、口蹄疫亚洲1型阳性血清和A型阳性血清,固相竞争ELISA方法和液相阻断ELISA方法的特异性分别是95．5％,84．7％。固相竞争ELISA方法检测口蹄疫亚洲1型、口蹄疫A型阳性血清时,无交叉反应,O型口蹄疫病毒感染牛、免疫牛和感染猪血清的阳性检出率均为100％,免疫猪检出率为86．7％。     

猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫效果试验

为了更好地了解猪口蹄疫O型合成肽疫苗与灭活疫苗免疫后抗体水平之间的差异．在梅小市选择2个规模化养猪场,每个猪场分2组,对试验猪分别免疫猪口蹄疫O型合成肽疫苗和猪口蹄疫O型灭活疫苗．对接种疫苗的试验猪进行免疫应激观察,结果显示：注射合成肽疫苗试验猪未出现不良免疫副反应．说明用合成肽疫苗临床使用的安全性较高;采用猪O型口蹄疫VP1抗体检测试剂盒和正向间接血凝试验分别对使用上述两种口蹄疫疫苗免疫21d后的猪血清进行检测,结果表明：免疫猪口蹄疫O型合成肽疫苗用猪O型口蹄疫VP1抗体检测试剂盒检测．抗体阳性合格率达到92．50％,免疫猪口蹄疫O型灭活疫苗用正向间接血凝试验检测,免疫合格率为35．83％,说明猪口蹄疫O型合成肽疫苗接种后的免疫效果明显优于传统灭活疫苗。     

口蹄疫在规模猪场的发生特点及防制对策

2010年3月1日,农业部新闻办公室发布了广州市白云区发生生猪口蹄疫疫情的消息：经国家口蹄疫参考实验室检测,确诊该起疫情为生猪O型口蹄疫疫情,发病生猪共1474头。据广东省畜牧兽医局副局长余业东通报,     

开阳县中小规模养殖场口蹄疫监测分析

为了解开阳县中小规模养殖场的口蹄疫防控情况,采用ELISA试验对52个中小规模养殖场猪O型口蹄疫免疫抗体和口蹄疫非结构蛋白3-ABC抗体进行检测,检测出3-ABC抗体阳性病例进一步通过RT-PCR检测口蹄疫病毒确诊。结果:猪O型口蹄疫免疫抗体共检测1 684份,合格率88.3%(1 487/1 684);口蹄疫非结构蛋白3-ABC抗体共检测1 684份,3-ABC抗体阳性9份,阳性率0.53%(9/1 684),进一步通过RT-PCR检测口蹄疫病毒,结果为阴性。结果表明,开阳县中小规模养猪场的猪O型口蹄疫免疫抗体效价达到国家农业部标准,有良好的免疫保护效果,没有检测出口蹄疫病毒,口蹄疫的防控处于良好状态。     

口蹄疫抗体液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验模型的建立与案例分析

液相阻断ELISA用于检测家畜血清中的口蹄疫抗体。主要应用于两个方面的目的：（1）检测口蹄疫病毒感染,广泛用于国际贸易中;（2）监测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫免疫抗体,评价口蹄疫疫苗免疫效力,也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力。     

南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

为满足口岸对南非II型口蹄疫检测、监测的需求,在对南非II型口蹄疫抗原表位分析及相关基因合成的基础上,进行融合蛋白pGEX—VP1-VP3的体外表达,采用柱上酶切方法制备VP1-VP3蛋白。将纯化VP1-VP3抗原包被96微孔板,分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度,确定阴性临界值。经反复优化,建立的南非II型间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为6．4ug／ml,血清最佳稀释度为1：200,酶标二抗最佳稀释度为1：4000,阴性临界值（0D450）为0．562。检测样品判定标准为：OD450〉0．622为阳性,OD450〈0．502为阴性,0．502≤OD450≤0．622为可疑。特异性试验结果表明,所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应。南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立为我国口岸口蹄疫检疫提供了新的查验方法。     

2011-2015年安顺市家畜口蹄疫免疫效果调查分析

为了解安顺市近5年家畜口蹄疫免疫效果,采用VP1结构蛋白抗体ELISA及液相阻断 ELISA方法对全市家畜口蹄疫免疫血清进行免疫抗体监测。结果表明：2012、2013年猪O型口蹄疫合成肽疫苗抗体检测合格率极显著下降( P<0.01),2012年猪O型口蹄疫佐剂灭活疫苗及牛O型口蹄疫－亚洲Ⅰ型双价苗抗体检测合格率极显著下降( P<0.01);羊O型口蹄疫－亚洲Ⅰ型双价苗抗体检测合格率总体呈逐年上升趋势( P<0.01),猪O型口蹄疫合成肽疫苗比猪O型口蹄疫佐剂灭活疫苗保护率高。     

比较3种间接ELISA试验检测口蹄疫感染抗体的研究

将3种检测口蹄疫非结构蛋白抗体的间接ELISA试验进行了比较。这3种间接ELISA试验检测田间血清样品的最低符合率为96％，最高符合率达98％：有2种间接ELISA试验可以检测到感染口蹄疫第10天后血清中的口蹄疫感染抗体．有1种间接ELISA试验可以检测到感染口蹄疫第14天后血清中的口蹄疫感染抗体；这3种间接ELISA试验检测12份已知口蹄疫阳性血清的试验结果吻合。研究表明．这3种间接ELISA试验方法对于检测口蹄疫感染抗体具有较好的特异性．其中猪口蹄疫3A蛋白间接ELISA诊断试剂盒在灵敏性、特异性和符合率方面更优于另外2种试剂盒。     

新疆某省际公路检查站调入牛羊口蹄疫、小反刍兽疫病原学检测

为了解跨省调运牛羊传播口蹄疫和小反刍兽疫的风险，以2021年1月23日—2月22日经某省际公路检查站调入新疆的牛羊及相关运输车辆、运输人员和检查站环境为调查对象，通过简单随机抽样，采用荧光RT-PCR方法进行口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒核酸检测。检测发现：在跨省调入新疆的牛羊中，1车次的1头牛检测为口蹄疫病毒核酸阳性（1/1 083），4车次的24只羊检测为小反刍兽疫病毒核酸阳性（24/2 034）；在环境监测中，有2辆运输车检测为小反刍兽疫病毒核酸阳性（2/60）。结果表明，跨省调运牛羊存在传播口蹄疫和小反刍兽疫等疫病的风险，需要规范做好跨省调运动物的检疫及疫病监测工作。     

不同口蹄疫疫苗免疫效果及检测方法评估

为更好地了解猪口蹄疫O型合成肽疫苗与猪口蹄疫O型灭活疫苗的免疫效果与合理的检测方法,广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场在某肥育场进行了此次试验。试验猪分3组,分别注射不同厂家生产的猪口蹄疫O型合成肽疫苗和猪口蹄疫O型OS／99株灭活疫苗,并采用猪O型口蹄疫VP1抗体检测试剂盒和正向间接血凝试验（HI）分别对使用上述口蹄疫疫苗免疫效果进行检测。结果表明,猪注射口蹄疫O型合成肽疫苗后,用猪0型口蹄疫VP1抗体检测试剂盒检测,抗体阳性率达到100％;用正向间接血凝试验方法检测不到注射合成肽疫苗后产生的抗体效价。免疫猪口蹄疫O型OS／99株灭活疫苗后,用VP1抗体检测试剂盒检测,抗体阳性率只有30％;用HI方法进行检测,抗体阳性率为60％。     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625 μg/mL,待...     

检测ＮＤＶ特异性ＩgG、IgM、ＩgA的间接ＥＬＩＳＡ方法的建立

本试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）感染的鸡胚尿囊液经差速离心，庶糖密度梯度离心提纯的ＮＤＶ为包被抗原，以纯化的鸡ＩgG、IgM及ＩgA免疫，制备辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡ＩgG、IgM及ＩgA，分别建立了检测ＤＮＶ特异性ＩgG、IgM、ＩgA的间接ＥＬＩＳＡ方法，抗原最适包被量为１．３４μg/孔。酶标兔抗鸡ＩgG、IgM、ＩgA的最佳稀释度分别为１：４００，１：４００，１：１００，血清样品检测ＩgG时，最适工作浓度为１：４００，检测IgM时为１：５０。该方法具有特异性强、灵敏度快，快速简便等优点，适合于对各类新城疫特异性抗体的动态监测和大批检测，同时也为城疫免疫要理研究及流行病学调查提供了可靠手段。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。     

1型鸭疫里氏杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

以1型鸭疫里氏杆菌(RA)全基因组保守区域ompA基因的重组表达产物为包被抗原,建立了检测RA血清抗体的间接ELISA方法。原核表达的重组ompA蛋白经纯化后作为包被物,以方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度为1.5μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100。与普通的微量凝集试验相比较,该方法灵敏度高于凝集试验约16倍～128倍。与鸭源大肠埃希菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭链球菌、鸭源呼肠病毒、鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒感染鸭血清均无交叉反应,表明该方法特异性好。利用该方法检测了雏鸭免疫RA灭活油乳剂疫苗之后血清抗体水平。     

犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

试验以利用重组弓形虫SAG1基因转染蜥蜴利什曼原虫所表达获得的目的蛋白作为包被抗原,建立了一种快速、特异、可检测犬弓形虫抗体的间接ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为6.75 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,对已知阳性血清检测的下限可达1∶6400,批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,包被抗原的酶标板在4、-20 ℃环境中可保存8个月以上。建立的间接ELISA方法应用于犬弓形虫抗体的检测具有较好的敏感性及特异性。     

SMD残留检测的ELISA方法的建立和初步应用

用戊二醛法将SMD与载体蛋白BSA偶联 ,制备合成抗原SMD BSA作免疫原 ,同法合成包被抗原SMD OVA ,免疫健康家兔获得抗血清。分别用双向琼脂扩散试验和ELISA试验对抗血清进行定性定量测定 ,结果表明所获抗血清特异性针对SMD。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件 ,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度 (50 μg/mL) ,抗血清最佳稀释度 (1∶1 0 0 ) ,酶标抗体的最适工作稀释度 (1∶50 0 ) ,并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在 1 0～ 2 0 0 0 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系。该法检测底限为 63μg/L,低于国际规定残留限量 (1 0 0 μg/kg)和国内规定残留限量 (30 0 μg/kg)的要求。本法同时测定了回收率以及实际样品血清中的SMD的残留含量     

猪支原体重组MSG1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为确定猪支原体在临床的感染情况和进行血清流行病学调查,本研究以原核表达纯化的猪支原体MSG1重组蛋白为包被抗原,建立了检测猪支原体的间接ELISA诊断方法。通过对ELISA反应一系列条件的优化,确定了最佳抗原包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭条件为用1%BSA37℃温箱内封闭2 h;血清最适稀释度为1∶200,作用时间为1.5 h;酶标二抗最适稀释度为1∶15 000,最适作用时间为1 h;最后37℃显色15 m in。判定标准为OD450≥0.239时判为阳性,OD450<0.198时判为阴性,0.198≤OD450<0.239时判为可疑。敏感性、特异性和可重复性试验证明,该检测方法敏感性高、特异性强和可重复性好。该研究表明建立的间接ELISA方法为猪支原体的检测和区域流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立

旨在建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法。经琼脂糖凝胶层析纯化大豆抗原蛋白,以不同剂量皮下注射免疫小鼠,采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法,利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体水平。通过方阵滴定法确定11S蛋白最佳包被浓度为5.0μg/mL,血清稀释倍数为1∶800;7S蛋白抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清稀释倍数为1∶1 600;两者的批内、批间系数均小于10%,重复性较好,通过ELISA法确定11S和7S蛋白的最佳免疫次数为2次,免疫剂量为1 000μg/kg。结果表明本试验初步建立大豆抗原蛋白抗体检测间接ELISA方法,具有很强的特异性、敏感性和重复性,可用于大豆抗原蛋白过敏反应的临床检测。