奶山羊乳腺组织5-HTR7基因的克隆与序列分析

根据GenBank其他物种5-HT受体-7(5-HTR7)基因序列的同源序列对奶山羊5-HTR7基因设计一对克隆引物,通过奶山羊乳腺组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物克隆、测序.结果显示,奶山羊5-HTR7基因的ORF与猴(NM-00193683)、大熊猫(XM-002926833)、猪(NM-214101)、大猩猩(ABO37534)和人(NM-000866)的同源性分别为21.3％、19.8％、20.7％、89.2％和76.2％,推测氨基酸序列与人和大猩猩在基因进化方面可见,羊和大猩猩的同源性最高,其次是与人.奶山羊5-HTR7基因推测氨基酸序列与人和大猩猩的同源性分别为73％和64％,相似性分别为81％和69％；氨基酸序列信号肽为1aa～17aa,SapB结构域均为59aa～126aa,结构特征与人和大猩猩的5-HTR7结构特征相一致.结论:克隆了奶山羊乳腺组织中5-HTR7基因,为进一步研究牛乳腺组织中5-HTR基因的分布和提高其泌乳量方面提供理论基础.     

萨能奶山羊乳腺组织5-HTR4基因的克隆序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计5-羟色胺受体4(5-HTR4)一对克隆引物,对萨能奶山羊乳腺组织中5-HTR4进行克隆、测序,并进行分析;再根据克隆序列设计引物,从重组克隆载体中扩增出含Bam HⅠ/XhoⅠ酶切位点的5-HTR4片段,酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-5-HTR4,经IPTG诱导进行表达、鉴定。奶山羊5-HTR4基因的ORF与兔(Z50162)、猪(NM-001173418)、人(human5HT1D)、狗(NM-001003280)和鼠(AK082016)的同源性分别为46.1%、47.2%、78.9%、45.8%及89.8%。Smart分析发现,奶山羊5-HTR4基因推测氨基酸序列信号肽与人、鼠5-HTR4基因氨基酸序列信号肽均为1～23aa,SapB结构域均为49～126aa,结构特征与人、鼠的5-HTR4结构特征相一致。     

西农萨能奶山羊乳腺组织LXRα基因CDS的克隆及序列分析

肝脏X受体α(LXRα)基因是核受体超家族的成员之一,可由巨噬细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、肠细胞等脂类代谢旺盛的细胞产生.LXR是调控胆固醇降解、吸收、从外围细胞中逆向转运、脂肪酸代谢及脂肪生成的关键酶.研究基于牛的LXRα基因序列,应用RT-PCR技术从西农萨能奶山羊乳腺组织中克隆LXRα基因编码区序列(CDs),并对测序结果进行生物信息学分析.LXRα基因完整编码区全长1 344 bp,编码447个氨基酸,西农萨能奶山羊LXRα基因CDs区核苷酸序列与牛、猪、小鼠、大鼠、人LXRα转录本1、2、3的LXRα基因CDs区核苷酸序列的分别为98%、93%、87%、87%、90%、79%、90%,山羊LXRα基因与牛LXRα基因存在23个核苷酸位点差异和6个氨基酸差异.     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列（登录号：XM_018066209.1）,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达（P<0.05）,其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

奶山羊CIDEa基因的克隆、序列分析与组织表达

为获得奶山羊CIDEa基因序列并检测其在乳腺组织中的表达,采用RT-PCR技术从奶山羊乳腺组织扩增CIDEa基因序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并采用荧光定量PCR检测CIDEa在干奶期和不同泌乳时期乳腺组织中的表达。结果表明:通过克隆测序得到奶山羊CIDEa基因CDS区660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank公布的绵羊、牛、人和猪的核苷酸序列同源性分别为99%、96%、85%、85%。奶山羊CIDEa蛋白属于碱性、不稳定亲水蛋白,不存在跨膜结构和信号肽;蛋白主要定位在细胞质、线粒体和细胞核。CIDEa蛋白结构主要由α螺旋、β折叠和不规则卷曲组成。奶山羊CIDEa在泌乳前期、盛期和中期乳腺组织中表达量均显著高于干奶期(P<0.05)。说明CIDEa可能参与奶山羊乳腺的泌乳过程,为进一步研究其在奶山羊乳腺组织中的功能及对乳品质的调控作用奠定基础。     

山羊ADD1基因部分序列的克隆与分析

提取湘东黑山羊基因组总DNA，用所设计的3对引物以聚合酶链式反应扩增山羊ADD1（Adipocyte Determination and Differentiation factor-1）基因，并进行克隆测序。序列分析表明所克隆的山羊ADD1基因包含exon 2～8、intron 2～7序列，将序列提交GenBank，获2个登录号：DQ480338、DQ487874；对编码序列（exon 2～8）与牛、人同区域进行Blast对比，同源性分别达到了96．14％和83．82％，所翻译氨基酸序列与牛属同源性更高达97．9％；此外，通过不同引物的测序结果比较，分别在exon6的第42处和intron6的第82处发现了一个碱基突变（C→T）和碱基插入／缺失（G／-），前者属于沉默突变，未引起氨基酸的变化。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物，对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT—PCR扩增，并将其克隆到pMD18-T载体上，分别获得了全长为817、851、854、854bp的全基因序列。序列分析结果表明，新疆毒株间的核苷酸同源性为97．8％～98．9%，氨基酸同源性为96．5％～98．7％，与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较，同源性为90．0％～99．4％；与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较，同源性为81．4％～99．3％。系统进化树分析表明，新疆株独立分支。     

猪ApoA5基因cDNA的克隆、序列分析及组织表达研究

旨在克隆猪ApoA5基因cDNA全序列,并对其进行序列分析,研究该基因的组织表达规律.试验以山西马身猪肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术,对猪ApoA5基因的cDNA进行克隆,并对其进行了生物信息学分析.采用荧光定量PCR检测并分析了ApoA5 mRNA在2个猪种(马身猪和大白猪)中多个组织的表达规律.结果表明:猪ApoA5基因cDNA全长1 917 bp,包括1 092 bp的开放阅读框(ORF),24 bp的3'-UTR和801 bp的5'-UTR;编码区(CDS)共编码364个氨基酸,与牛、马、人、犬、猴、兔、褐鼠和小鼠氨基酸序列的同源性分别为81.7％、80.0％、78.3％、77.5％、76.5％、73.6％、67.1％和66.7％;ApoA5 mRNA除了在肺脏和脾脏中未检测到外,在其他8种组织中均有表达,其中在肝脏组织中高丰度表达,在皮下脂肪与背最长肌中中等表达,低量表达于小肠、肾脏、心脏、胰脏和胃,并且在皮下脂肪与背最长肌中ApoA5 mRNA的表达量存在显著的品种差异.猪ApoA5基因在动物进化中比较保守,ApoA5 mRNA的表达量受到组织和品种影响,推测ApoA5基因对脂肪沉积性状有一定的影响.     

猪呼吸道冠状病毒S1基因的克隆与序列分析

以猪呼吸道冠状病毒(PRCV)AR310毒株为研究对象,观察PRCV在两种不同细胞中的生长繁殖情况,在猪肾原代细胞中生长良好,在PK15细胞中未见生长。参考GenBbank中已发表的基因序列,设计和合成一对引物,通过RT-PCR扩增出PRCVAR310株的S1基因,克隆到pMD18-T载体中并测序。结果表明与PRCVDQ811787核苷酸同源性为100%,与M94096、M94097的同源性分别为95.2%和95.0%;氨基酸序列分析表明,试验测序的PRCVS1基因氨基酸序列与Genebank中DQ811787同源性为100%,与M94096、M94097的同源性较高分别为95.2%和95.6%。     

奶山羊短链脂肪酸受体GPR41基因的克隆及组织表达分析

旨在克隆奶山羊GPR41(G protein-coupled receptor 41)基因并分析其组织表达谱,为进一步探讨其功能奠定基础.根据GenBank上已登录的牛、人和鼠的GPR41基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法克隆奶山羊GPR41基因,利用实时荧光定量PCR方法分析奶山羊GPR41 mRNA表达的组织特异性.测序结果表明奶山羊GPR41基因的CDS区为978 bp,共编码325个氨基酸.奶山羊GPR41基因序列同源性分析表明:其与牛、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为96％、78％和74％,与牛、人和鼠的氨基酸序列同源性分别为97％、76％和74％.实时荧光定量PCR分析结果表明:奶山羊GPR41基因在小肠组织中表达量最高,其次是乳腺组织,在心脏和肾脏中表达量极低.试验结果表明GPR41可能在小肠和乳腺组织中发挥着重要的生理作用.     

水貂TOll样受体5编码区基因的克隆及序列分析

为了解水貂Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和遗传演化关系,采用RT-PCR方法从水貂肺脏组织总RNA中扩增出TLR5基因的片段,经拼接获得全长编码区序列。序列全长2 577 bp,编码858个氨基酸,含172%的亮氨酸,并有一段20个氨基酸的信号肽序列。蛋白预测结果表明,该分子具有亲水性,由胞外区(具有LRR结构域)、跨膜区和胞内区(具有TIR结构域)组成,表现出典型的TLR家族结构特征;同源性分析结果显示,与蒙眼貂同源性最高,达97%以上,与海象、大熊猫和北极熊同源性80%以上,与其他物种同源性大都在70%以上。水貂TLR5基因序列的成功克隆为进一步研究其在水貂机体免疫应答中的作用奠定了基础。     

Molecular cloning and sequence analysis of feline interferon-stimulated gene 15

The interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is induced by type I interferon (IFN). Recent studies have revealed that like ubiquitin, ISG15 is conjugated with target proteins. In this study, the feline ISG15 (FeISG15) gene was cloned from feline IFNomega (FeIFNomega)-stimulated feline kidney epithelial (CRFK) cells. According to gene sequence results, cDNA was 474bp long and encoded a protein of 157 amino acids. The putative amino acid sequences showed 62.5-72.1% identity with those of other mammalian ISG15s. Similar to human and mouse ISG15, FeISG15 included tandem ubiquitin-like domains; its homology with feline ubiquitin was 36.3-39.5%. The LRLRGG conjugating motif was located only in the carboxyl terminal ubiquitin-like domain. FeISG15 also lacked the carboxyl terminal extension after the LRLRGG motif, which is present in mouse and human ISG15. Recombinant FeISG15 protein was expressed as a His-tagged fusion protein in Escherichia coli and purified by ion-exchange chromatography followed by affinity chromatography. Monoclonal anti-FeISG15 antibodies revealed free FeISG15 and FeISG15 conjugated with target proteins in cells after IFNomega stimulation by Western blotting analysis. Furthermore, mRNA of IFNgamma was detected from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) after stimulation with rFeISG15 extracellularly by RT-PCR. Taken together, these results suggested that FeISG15 had ubiquitin- and cytokine-like activity, as in other species.     

杜氏盐藻CDPK基因的克隆及其序列的分析

首先对拟南芥Arabidopsis thaliana等其他物种CDPK基因的同源序列进行相似性分析,设计1对简并引物,利用RT-PCR技术获得一个长636 bp的片段,经克隆测序分析发现其同拟南芥的CDPK基因有60.3%的相似性,然后再以此片段为模板设计引物,通过RACE技术构建杜氏盐藻Dunaliella salinaCDPK基因的全长序列。在GenBank中进行Blastp检索,发现该片段与许多植物CDPK基因具有较高的相似性(50.2%~73.0%)。     

骡朊病毒基因克隆与序列分析

传染性海绵状脑病（TSEs）是一种可引起人和动物一系列神经退化性疾病的一种新型传染病,包括羊痒病（scrapie）、牛海绵状脑病（BSE）、鹿的慢性消耗性疾病（CWD）,水貂海绵状脑病（MSE）,猫的疯猫病（FSE）,人克雅氏病（CJD）。疾病的致病机理并不清楚,但是朊蛋白被认为是感染性因子。1986年暴发的疯牛病给英国造成很大的损失,而且变异型克雅氏病（vCJD）被认为是人类食用了被疯牛病污染的牛肉发生的,引起了全世界的恐慌。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离与VP2基因序列分析

为了探讨传染性法氏囊病流行的原因,从4个发生传染性法氏囊病的鸡场采集病变法氏囊,处理后用特异性单克隆抗体进行荧光检测,结果均为阳性;然后提取病毒RNA,利用RT-PCR扩增病毒VP2基因cDNA并进行序列和遗传进化分析.结果表明:所分离的4株病毒均具有超强毒的分子特征,属于传染性法氏囊病病毒超强毒病毒群,4株病毒在第1亲水区的212位有1个氨基酸突变(D→N);HLJ-3和HLJ-4在第2亲水区321位还有1个突变(A→V),这些突变可能造成传染性法氏囊病病毒的抗原发生变异,进而发生免疫失败.     

民猪磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)基因部分片段的克隆与分析

试验采用比较基因组学结合克隆测序的方法首次获得了民猪的磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的第9,10,12内含子序列,并对测序结果进行了比对。结果表明:磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的第9内含子存在2个点突变(120 G→C和185 C→G),后者造成NlaⅢ酶切位点的缺失;第10内含子存在1个点突变(129 T→C),该点突变造成AceⅠ酶切位点的缺失;第12内含子处没有发现突变位点。     

Sequencing of canine 5-hydroxytriptamine receptor (5-HTR) 1B, 2A, 2C genes and identification of polymorphisms in the 5-HTR1B gene

Polymorphisms of human genes encoding 5-hydroxytriptamine (serotonin) receptors (5-HTRs) are thought to be associated with psychiatric disorders and behavioral traits. In the present study, we searched for corresponding polymorphisms in the dog and compared allelic frequencies for the canine 5-HTR1B, 5-HTR2A, and 5-HTR2C genes among five canine breeds. The canine genes consisted of the following: 5-HTR1B, 1170 bp; 5-HTR2A, 1413 bp; and 5-HTR2C, 1377 bp. All of these genes were highly homologous with the human genes. We found six single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the 5-HTR1B gene (G57A, A157C, G246A, C660G, T955C, and G1146C). Genotyping of the respective SNPs revealed that there were inter-breed variations in the genotypes and allelic frequencies for four out of the six identified SNPs, suggesting that further analyses of the polymorphisms of the 5-HTR1B gene would be useful in order to gain an understanding of the genetic background underlying the diversified behavioral traits among canine species.