致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

日本鳗鲡败血腹水病病原研究

2000年3月中旬，自福建仙游某日本鳗鲡（Anguilla japonica)养殖场患败血腹水症的发病日本鳗鲡的肝脏及腹水处分离到四株细菌，经鉴定其中一株为迟钝爱德华氏菌（dwardsiella tarda)，一株温和气单胞菌（Aeromomas sobria)和两株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)溶血试验，小鼠攻毒试验显示，上述四株细菌都有较强制 毒力，综合分析，上述菌株可能是引发这次日本幼鳗败血腹水病之病原菌。     

重组抗菌肽的制备及其对水产养殖中常见病原菌的抑菌效果

采用YEPD培养基诱导发酵生产重组抗菌肽。经 72h培养 ,由重组酵母表达并分泌到培养基中的抗菌肽活性可高达 5 0 0 0U/ml。用纸片扩散法和试管稀释法测定重组抗菌肽对水产养殖常见病原菌的抑菌效果。结果表明 ,抗菌肽对水产养殖常见病原菌嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)、梅氏弧菌 (Vibriometschnikovi)、迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiellatarda)及温和气单胞菌 (A .sobria)有较好的抑菌效果 ,最小抑菌质量浓度为 4 μg/ml、杀菌质量浓度为 8μg/ml。对抗菌肽抑菌过程的超微结构观察表明 ,抗菌肽的抑菌方式是通过作用于细菌的细胞膜而导致菌体裂解死亡。本研究目的在于探讨基因工程抗菌肽在水产养殖中的应用。     

5种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

本研究建立一种同时特异性地检测5种常见食源性致病菌的多重PCR方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis、福氏志贺氏菌Shigella flexneri的相关毒力基因,选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因,设计5对特异性引物进行多重PCR检测,对反应条件进行优化并评价了其特异性和灵敏度。通过对48份实际样品检测,验证了此多重PCR体系具有很好的可靠性和实用性。     

河蟹疾病综合防治技术（下）

5.肝坏死病病因、症状:病原为嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、产气菌、弧菌侵袭,及由饲料霉变和底质污染并发引起,病蟹肝脏呈灰白色,有的呈黄绿色,鳃部腐烂,一般伴有烂鳃症状。预防:注意饲料的质量,定期采用护肝泰200克 氟尔康100克 Vc 50克拌饵料50千克投喂,每15～20天使用一次。治疗:①全池泼洒"菌毒净"250～300毫升/亩·米;②内服护肝泰200克 氟尔康100克 Vc 50克拌饵料25千克投喂,连用5天。     

病原迟钝爱德华菌毒力基因及双重PCR与LAMP检测方法的建立

为明确牙鲆及大菱鲆病原迟钝爱德华菌毒力基因的携带情况并建立分子检测方法,实验以迟钝爱德华菌fimA、fimB、gadB及citC为靶基因设计特异性引物,进行PCR扩增及环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并对其特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果显示,10株病原迟钝爱德华菌均扩增出fimA、fimB、gadB及citC 4种毒力基因,目的条带大小分别为240、217、171及119 bp,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA和gadB设计的两对引物进行的双重PCR扩增,同一PCR反应体系中病原迟钝爱德华菌可扩增出240和171 bp两条目的条带,且灵敏度为3.0×10³ CFU/mL,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA设计的4条特异引物进行的LAMP扩增,病原迟钝爱德华菌可扩增出阶梯状条带,反应产物加入荧光染料SYBR Green Ⅰ后反应液呈现明显的绿色阳性反应,4株对照菌无阶梯状扩增条带且呈现橙色阴性反应,灵敏度为3.0×10¹ CFU/mL,比双重PCR的检测限要低100倍。研究表明,操作简便、快速且特异性及灵敏性强的LAMP检测方法,对迟钝爱德华菌引起的水产动物疾病的快速诊断具有实践意义。     

应用PCR快速诊断黄鳝嗜水气单胞菌败血症

根据致病性嗜水气单胞菌的标志性毒力基因-气溶素(aerolysin)基因序列,设计出一对特异性引物,采用PCR方法,对22尾临床疑似患嗜水气单胞菌败血症的黄鳝进行了诊断,检测出其中17尾呈致病性嗜水气单胞菌阳性,检测过程仅需6h;而常规细菌分离鉴定则耗时72 h,检出率仅为9/22.     

对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。     

牛蛙爱德华氏菌病病原菌的鉴定和致病因素的研究

从患爱德华氏菌病的牛蛙肌肉、肝、肾、血液和腹水中分离到8株细菌，根据其形态和生理生化特性鉴定为野生型迟钝爱德华氏菌。人工感染实验均为该病的病原菌，毒素检测试验表明，致病因素主要是内毒素而不是外毒素。分离菌株的主要特性为杆状、革兰氏阴性、周生鞭毛、兼性厌氧。接触酶、甲基红试验和硝酸盐还原均为阳性。在三糖铁琼脂上产H2S。氧化酶、丙二酸盐利用、V．P试验、明胶液化、尿素酶。苯丙氨酸脱氨酶为阴性。分解葡萄糖、甘露糖、麦芽糖，产酸产气，不利用甘露醇、蔗糖和阿拉伯糖。     

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在Tm为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x 39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,三个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。实验结果表明所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。     

41种中草药对3种鲟源病原菌的体外抑菌效果

采用平板打孔法在观察了弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等3种鲟源病原菌对41种中草药敏感性的基础上,进一步采用二倍稀释法测定了具有良好抑菌活性的中草药对3种病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。实验结果表明,3种病原菌对乌梅、石榴皮、地榆、杞子等均高度敏感,对杜仲、柴胡、丹参、熟地黄等均中度敏感,对麦冬、当归、胖大海、玉竹均不敏感。此外,乌梅、石榴皮、地榆、杞子对3种病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为7.81 mg/mL和15.625 mg/mL、15.625 mg/mL和31.25 mg/mL、15.625 mg/mL和31.25 mg/mL以及15.625 mg/mL和31.25 mg/mL,而杜仲、柴胡、丹参、熟地黄等中度敏感中草药对3种病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均分别高于31.25 mg/mL和62.5 mg/mL。     

鱼类嗜水气单胞菌的几种检测方法

嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）属于弧菌科气单胞菌属，是危害鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物的致病菌，分布广泛。各种淡水鱼均可感染，表现为皮肤溃疡的慢性型及鳃的“红皮炎”，更多的则是败血症急性死亡。人工养殖的温水鱼在水温较高的季节发病率最高。自１９８９年以来，淡水鱼暴发性传染病在我国广为流行，造成严重的经济损失，病原大多数为嗜水气单胞菌犤１犦。特种名贵鱼类如：香鱼、黄鳝等也可感染本病犤２，３犦。此外，在冷水鱼及观赏热带鱼中亦有类似报道。目前，已经确诊曾感染本菌的重要养殖鱼类有鲫、鲢、鲤、草鱼…     

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。     

迟钝爱德华氏菌在水产动物中致病性及致病因子的若干研究

正迟钝爱德华氏菌又称迟缓爱德华氏菌或缓慢爱德华氏菌,属于肠杆菌科的爱德华菌属(Edwardsiella)。它是该细菌家族中较早发现的成员之一。于1959年由日本的Sakazaki和Murata首先从蛇的肠道中分离得到。E.tarda是一种革兰氏阴性短杆菌,没有荚膜、芽孢,长度约2~3μm,直径约lμm,有周生鞭毛,能运动。该菌为兼性厌氧菌,生长温度范围为5~42℃,最适生长温为25~35℃;适宜pH范围为5.5~9.0,但pH7.2时生长较好;耐盐浓度范围为0~4%。同时,E.tarda可产H2S,能在胆硫乳琼脂(DHL)上形成黑色中心的特征菌落。     

同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和应用

淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物,并对扩增体系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为：Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl,10×PCR Buffer(含20 mmol/L的Mg2+)5μl,dNTP(各2.5 mmol/L)5μl,10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl,模板1μl,ddH2O补足至50μl,退火温度为56℃。研究结果显示,该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为101 copies/μl (RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、102 copies/μl (LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和103 copies/μl (大菱鲆红体病虹彩病毒,TRBIV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。     

水产品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立及评价

根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH和副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR设计引物,建立一种快速检测水产品中上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法。结果显示,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR扩增片段产物大小分别为549、426、348和243 bp,该检测方法具有良好的特异性和灵敏度。设计优化了可用于水产样品中4种目标致病菌的共增菌培养基,该方法应用于35份实际水产样品的检测,并与国标方法对比验证,4种致病菌的整体符合率达94%以上,两种检测方法无显著性差异(P>0.05)。可见,该多重PCR方法可应用于水产品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及志贺氏菌4种食源性致病菌的快速检测和分子流行病学调查。     

中华鳖白底板病病原的分析

从患白底板病的中华鳖(Trionyx sinensis)肾、肝、脾分离出致病力较强的细菌TS6-1和TS6-2。同时样品经超薄切片,电子显微镜观察,在脾、肝、肾组织细胞质中观察到直径为30 nm病毒样颗粒。经人工感染试验证实,分离菌株及患病鳖内脏组织过滤液均可导致中华鳖发病死亡,TS6-1和TS6-2的LD50分别为3.2×107CFU/mL和1.0×108CFU/mL。以患病鳖肝、脾组织的过滤液注射健康鳖后,3～5天内所有鳖全部死亡。通过对细菌形态、生理生化特性的测定,判定TS6-2属于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。同时对TS6-1进行了16S rRNA分子鉴定,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与迟缓爱德华氏菌的16S rRNA基因具有较高的同源性(99%),该序列在GenBank上的登录号为DQ884466。结合细菌的生理生化特性,判定TS6-1属于迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tard)。由此认为中华鳖白底板病由病毒和嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌混合感染引起。药敏试验结果表明,TS6-1对先锋V、丁胺卡那敏感,TS6-2对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那敏感。     

1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究

从池塘养殖的团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道中分离筛选出15株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)拮抗菌,其中菌株S24在平板贴片试验中对供试的嗜水气单胞菌菌株具有稳定和较高的拮抗作用。综合形态学观察、生理生化指标检测及分子序列(16S rDNA,gyrB)分析,将菌株S24确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。拮抗菌S24和嗜水气单胞菌(菌株43)的共凝集率为(36.0%±4.3%)。共培养试验可见拮抗菌S24能明显抑制嗜水气单胞菌43的增殖;共培养18 h时,嗜水气单胞菌43的细胞数量达到最低。试验结果表明,拮抗菌株S24适宜作为潜在防治嗜水气单胞菌病的益生菌。     

鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联表达外膜蛋白的免疫原性

采用鳗鲡源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)外膜蛋白基因二联表达产物免疫日本鳗鲡(Anguilla japonica),检测其对日本鳗鲡免疫功能的影响及其攻毒免疫保护力。将150尾日本鳗鲡平均分为PBS、细菌免疫和外膜蛋白免疫3个组,3组鳗鲡分别以PBS(0.01 mol/L,p H7.4)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌二联灭活苗(5.0×108 CFU/m L)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物(500μg/m L)腹腔注射0.2 m L。于免疫后14、21和28 d麻醉鳗鲡采血并分离抗凝血。测定3个时间点鳗鲡血浆中特异性抗体效价和同时期鳗鲡血浆、体表黏液、肝和肾组织匀浆液中的溶菌酶含量,同时检测3个时间点鳗鲡全血细胞的转化水平。免疫后28 d,嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌分别腹腔注射感染3组鳗鲡并测定其相对免疫保护率。结果表明,免疫后14 d和28 d,灭活菌和外膜蛋白免疫组的抗体水平均极显著高于PBS组(P0.01)。溶菌酶检测结果表明,不同处理组不同时间段血清、黏液和肝肾组织悬液的溶菌酶含量存在显著(P0.05)或极显著(P0.01)差异。免疫后14 d灭活菌组全血细胞转化水平显著高于PBS和外膜蛋白组(P0.05),而21 d两个免疫组则均显著低于PBS组(P0.05)。活菌感染结果表明,灭活菌和外膜蛋白免疫后28 d对两株病原菌的攻毒相对免疫保护率均比PBS组提高了50%(P0.05)。本研究结果表明鳗鲡源嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物免疫日本鳗鲡后可提高鳗鲡的免疫功能及其对这两株菌的抵抗力,从而可能应用于鳗鲡基因工程疫苗的研发。