5种淡水细菌的多重PCR检测方法的建立及其应用

细菌对水产养殖品种危害大,造成的经济损失高。传统的显微镜镜检方法检测细菌误差大,而利用PCR方法鉴定细菌种类特异性强,准确性高。利用多重PCR探索出一种能准确鉴定水产常见细菌。研究表明,利用PCR分别扩增了嗜水气单胞菌Hly A基因,肺炎克雷伯菌Khe基因,无乳链球菌Sip基因,爱德华氏菌Ser C基因和Eip基因以及迟钝爱德华氏菌Muk F基因和Gad B基因,扩增特异性强。并成功地建立了一种同时用于无乳链球菌和爱德华氏菌等两种细菌以及爱德华氏菌、肺炎克雷伯菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等4种细菌的多重PCR检测方法。为了验证多重PCR方法的准确性,采集患病黄鳝病灶部位,分离培养细菌并提取该细菌基因组DNA,用上述两种多重PCR方法检测出患病黄鳝体内感染的细菌主要是肺炎克雷伯菌和嗜水气单胞菌。建立的多重PCR检测方法对水产常见致病菌的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义,为鱼类的疾病诊断提供了依据。     

迟钝爱德华菌环介导等温扩增检测方法研究

为了建立一套用于实验室及室外现场检测迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda, Et)的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，以迟钝爱德华菌的毒力基因fimA为靶基因设计特异性引物，以基因组DNA为模板，进行环介导恒温扩增，并对其特异性、灵敏性和临床检测进行了试验。结果显示，迟钝爱德华菌阳性样本反应呈现为荧光绿色，阴性样本不变色。该LAMP方法的最适反应温度为63℃；特异性试验表明仅迟钝爱德华菌样本发生反应，而杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温气单胞菌和豚鼠气单胞菌均不发生反应；敏感性试验表明，该LAMP方法可检出浓度为2.16×10^-5mg/L的迟钝爱德华菌的核酸。     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

牙鲆腹水病病原免疫血清的制备和纯化试验研究

用迟钝爱德华氏菌免疫家兔,制备出高效价迟钝爱德华氏菌免疫血清.先制备迟钝爱德华氏菌抗原, 耳缘静脉注射免疫家兔.经微量反应板法检测血清效价, 效价达到1 ∶ 2560;用Millipore Montage抗体纯化试剂纯化抗体,纯化的抗体经SDS-PAGE电泳,杂带较少,条带主要集中于50 kD处;用斑点酶联免疫吸附试验检测时, 迟钝爱德华氏菌呈阳性, 温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性.试验结果表明,特异、高效价的迟钝爱德华氏菌免疫血清,为快速检测牙鲆腹水病病原奠定了基础.     

斑点叉尾鮰肠败血症（ESC）PCR

由鮰爱德华氏细菌引起的肠败血症（ESC，又称爱德华氏病）是影响斑点叉尾鮰养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病，本研究以NCBI公布的妇爱德华氏细菌eip基因（GeneBank登录号为AF037441）为模板序列，设计种特异性诊断引物，成功建立了用于斑点又尾鮰肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明。该方法能够直接从发病斑点叉尾鮰脑、肝、脾和肾组织中检测到妇爱德华氏菌，检测的最低量为21个细菌；同时，该诊断方法与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、拄状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河孤菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交又反应。临床样品检测证明。本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾鮰肠败血症的快速诊断。     

斑点叉尾肠败血症(ESC)PCR诊断方法的建立

由爱德华氏细菌引起的肠败血症(ESC,又称爱德华氏病)是影响斑点叉尾养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病,本研究以NCBI公布的爱德华氏细菌eip基因(GeneBank登录号为AF037441)为模板序列,设计种特异性诊断引物,成功建立了用于斑点叉尾肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明,该方法能够直接从发病斑点叉尾脑、肝、脾和肾组织中检测到爱德华氏菌,检测的最低量为21个细菌;同时,该诊断方法与I型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交叉反应。临床样品检测证明,本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾肠败血症的快速诊断。     

应用Dot-ELISA快速检测牙鲆腹水病病原的研究

选用硝酸纤维素膜作固相载体,建立检测迟钝爱德华氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法。根据棋盘试验,确定迟钝爱德华氏菌免疫血清最佳工作浓度为1∶800,酶标抗体最佳工作浓度为1∶200,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。试验结果表明,Dot-ELISA方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。     

长江所“一种甲基营养型芽孢杆菌YFI-1及在制备水产细菌抑菌剂中的应用”获国家发明专利授权

正日前,中国水产科学研究院长江水产研究所薛明洋等科研人员申请的"一种甲基营养型芽孢杆菌YFI-1及在制备水产细菌抑菌剂中的应用"获国家发明专利授权,专利号为ZL201910767184.7。该发明中的甲基营养型芽孢杆菌YFI-1对水产病原菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、爱德华氏菌、霉实假单胞菌、无乳链球菌均具有良好的抑制效果,可以作为     

带鱼肠道中芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵液抗菌性质研究

从带鱼肠道中分离筛选到1株具有广谱抗菌活性的菌株JFL15,其发酵液对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、查氏弧菌均有较强抑菌作用。通过形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育进化分析,菌株JFL15与暹罗芽孢杆菌的同源性最高,达98.05%,初步鉴定为暹罗芽孢杆菌。对暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液进行研究发现,暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液对酶、温度、酸碱度和紫外线均不敏感,且发酵产物储存较长时间后仍具有较强抑菌活性。     

应用PCR快速诊断黄鳝嗜水气单胞菌败血症

根据致病性嗜水气单胞菌的标志性毒力基因-气溶素(aerolysin)基因序列,设计出一对特异性引物,采用PCR方法,对22尾临床疑似患嗜水气单胞菌败血症的黄鳝进行了诊断,检测出其中17尾呈致病性嗜水气单胞菌阳性,检测过程仅需6h;而常规细菌分离鉴定则耗时72 h,检出率仅为9/22.     

二温式聚合酶链反应鉴别诊断迟缓爱德华氏菌病

根据迟缓爱德华氏菌株23S rDNA基因,设计合成一对引物XZE15、XZE16,建立了二温式聚合酶链反应(PER)鉴别诊断迟缓爱德华氏菌株的技术.特异性试验表明,对3株迟钝爱德华氏菌株进行PCR扩增出与预期大小相一致的284 bp的特异性片段,但对3株钻鱼爱德华氏菌及其他对照鱼病病原体核酸模板的PCR扩增不出现任何条带;敏感性试验结果显示,该二温式PCR可以检测到10 Pg的迟钝爱德华氏菌DNA.     

鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联表达外膜蛋白的免疫原性

采用鳗鲡源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)外膜蛋白基因二联表达产物免疫日本鳗鲡(Anguilla japonica),检测其对日本鳗鲡免疫功能的影响及其攻毒免疫保护力。将150尾日本鳗鲡平均分为PBS、细菌免疫和外膜蛋白免疫3个组,3组鳗鲡分别以PBS(0.01 mol/L,p H7.4)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌二联灭活苗(5.0×108 CFU/m L)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物(500μg/m L)腹腔注射0.2 m L。于免疫后14、21和28 d麻醉鳗鲡采血并分离抗凝血。测定3个时间点鳗鲡血浆中特异性抗体效价和同时期鳗鲡血浆、体表黏液、肝和肾组织匀浆液中的溶菌酶含量,同时检测3个时间点鳗鲡全血细胞的转化水平。免疫后28 d,嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌分别腹腔注射感染3组鳗鲡并测定其相对免疫保护率。结果表明,免疫后14 d和28 d,灭活菌和外膜蛋白免疫组的抗体水平均极显著高于PBS组(P0.01)。溶菌酶检测结果表明,不同处理组不同时间段血清、黏液和肝肾组织悬液的溶菌酶含量存在显著(P0.05)或极显著(P0.01)差异。免疫后14 d灭活菌组全血细胞转化水平显著高于PBS和外膜蛋白组(P0.05),而21 d两个免疫组则均显著低于PBS组(P0.05)。活菌感染结果表明,灭活菌和外膜蛋白免疫后28 d对两株病原菌的攻毒相对免疫保护率均比PBS组提高了50%(P0.05)。本研究结果表明鳗鲡源嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物免疫日本鳗鲡后可提高鳗鲡的免疫功能及其对这两株菌的抵抗力,从而可能应用于鳗鲡基因工程疫苗的研发。     

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。     

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

背角无齿蚌血清的抑菌活性

对２０种细菌生长的影响试验结果表明,背角无齿蚌血清对嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、类志贺邻单胞菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌等１２种细菌的生长具不同程度的抑制作用;而对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、灵菌、金黄色葡萄球菌等８种细菌无生长抑制作用。背角无齿蚌血清对嗜水气单胞菌生长的抑制作用强弱具有个体差异,抑制强度与血清的加入量直接相关,而偏高的温度会使血清的抗菌能力下降。     

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

解淀粉芽孢杆菌HE活性成分鉴定及抗菌特性分析

为明确解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HE发酵液中的活性成分及抗菌特性,根据解淀粉芽孢杆菌发酵液抑菌活性稳定性,用PCR检测脂肽合成相关的基因,再采用UPLC-Q-TOF-MS对活性物质进一步分析;用二倍稀释法测定脂肽对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并从显微结构上来探讨其抗菌作用。稳定实验表明该菌株产生抑菌活性物质对高温、酸、碱和蛋白酶具有一定的耐受性;4对引物的扩增产物经过克隆、测序和BLAST分析,表明解淀粉芽孢杆菌HE基因组含有ituA、fenB、sfP、mycB的脂肽合成相关基因;液质联用分析发现脂肽粗提物中含有Surfactin、Iturin和Fengycin这3类脂肽类抗生素;抑菌圈法测定抗菌脂肽对嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为137.97μg·mL-1;显微特征表明脂肽可以导致嗜水气单胞菌细胞膜塌陷和孔洞。该研究结果可为解淀粉芽孢杆菌活性代谢产物结构鉴定和安全性评价提供参考。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

病原迟钝爱德华菌毒力基因及双重PCR与LAMP检测方法的建立

为明确牙鲆及大菱鲆病原迟钝爱德华菌毒力基因的携带情况并建立分子检测方法,实验以迟钝爱德华菌fimA、fimB、gadB及citC为靶基因设计特异性引物,进行PCR扩增及环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并对其特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果显示,10株病原迟钝爱德华菌均扩增出fimA、fimB、gadB及citC 4种毒力基因,目的条带大小分别为240、217、171及119 bp,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA和gadB设计的两对引物进行的双重PCR扩增,同一PCR反应体系中病原迟钝爱德华菌可扩增出240和171 bp两条目的条带,且灵敏度为3.0×10³ CFU/mL,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA设计的4条特异引物进行的LAMP扩增,病原迟钝爱德华菌可扩增出阶梯状条带,反应产物加入荧光染料SYBR Green Ⅰ后反应液呈现明显的绿色阳性反应,4株对照菌无阶梯状扩增条带且呈现橙色阴性反应,灵敏度为3.0×10¹ CFU/mL,比双重PCR的检测限要低100倍。研究表明,操作简便、快速且特异性及灵敏性强的LAMP检测方法,对迟钝爱德华菌引起的水产动物疾病的快速诊断具有实践意义。