杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析

从广东佛山、广州两地养殖场患内脏类结节病杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)内脏器官分离到2株细菌,纯化培养后获得2个分离株,编号为WL-1和WL-2,对分离菌株进行了细菌鉴定、致病性分析及药敏实验。应用常规生理生化鉴定和ATB系统细菌自动鉴定仪对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为舒伯特气单胞菌。采用16S rRNA基因、DNA促旋酶的B亚单位蛋白(gyrB)基因对分离菌株进行DNA分子鉴定,结果显示,两个菌株间的16S rRNA基因序列相同,gyrB基因序列同源性为99.7%;分离菌株与GenBank上登录的舒伯特气单胞菌16S rRNA基因序列和gyrB基因序列同源性均最高,达99%以上;分离菌株在系统进化树上与舒伯特气单胞菌聚为一族,进一步确认分离株为舒伯特气单胞菌。人工感染健康鱼后出现与自然发病相似的内脏类结节病症状,从发病鱼内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同。综合理化特性分析、基因鉴定和人工感染实验确认舒伯特气单胞菌是杂交鳢内脏类结节病的致病菌。药敏实验发现分离菌株对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感;对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受。     

虾源哈维氏弧菌的致病性与生物学特性比较分析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是导致养殖对虾暴发弧菌病的重要病原之一。从我国南方养殖凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)分离、鉴定了10株哈维氏弧菌(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487),分别肌注感染健康凡纳滨对虾后发现,菌株Vh21229致病性很弱,Vh00949其次,其它菌株毒力较强;对8种哈维氏弧菌常见毒力基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、tox S、hcp、zot和pap6)的检测显示,南方虾源哈维氏弧菌无论强弱毒株都很少携带zot、pap6、toxs和4种Vh基因(≤10%),表明这10个菌株的致病性与这7种常见毒力因子的相关度很低;hcp基因在所有菌株中均有检出,其中强毒株中检出率较高(50%),在较弱毒株(Vh00949)中也存在,表明hcp基因与这些菌株的致病性密切相关,但不是决定性因子。因此,这10株南方虾源哈维氏弧菌菌株的致病性差异应由这8种常见毒力因子以外的未知或未检测到的因子所决定。生化特征分析显示,所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖,而且只有其赖氨酸脱羧酶反应至阳性,而其它菌株均为阴性,推测导致哈维氏弧菌菌株生化特性改变的某种因子可能对菌株的致病性也产生了影响。药敏实验表明,10株哈维氏弧菌均对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星敏感,而对氨苄西林耐受性强,表明在虾类养殖过程中应当严格规范和控制抗菌药物尤其是青霉素类药物的使用。     

养殖澳洲宝石鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及致病基因的检测

从患病澳洲宝石鱼体内分离到一株致病菌(编号Et4),对该菌的生化特性及致病基因进行检测,并进行了药敏和人工感染实验。结果显示:菌株Et4的生化鉴定结果与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)标准菌株(AY77513)一致;其16S rRNA序列,经同源性比对与迟缓爱德华氏菌核苷酸相似度最高,达99%;根据迟缓爱德华氏菌的致病基因Ⅲ型分泌系统装置蛋白esaV基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到708 bp序列,该序列与迟缓爱德华氏菌的esaV基因序列相似性达99.3%,说明菌株Et4具有esaV基因。菌株Et4对环丙沙星等较敏感,对其它药物中度或不敏感,具有较强的致病力(LD50=3.74×104CFU/mL),从病鱼中可以重新分离出此菌。综合形态学、生化特性、16S rDNA序列及致病基因序列鉴定其为迟缓爱德华氏菌。     

一株史氏鲟源腐生葡萄球菌的分离鉴定及其基因组分析

从周宁县某养殖场史氏鲟病灶样品中分离出1株多重耐药革兰氏阳性菌JY08,为了进一步研究其进化地位、耐药机制和潜在致病因子,采用形态学特征、16S rRNA基因序列、生理生化特征和系统发育树对其进行鉴定。结果显示,菌株JY08的形态特征和生理生化特性与腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)基本一致;16S rRNA基因序列与腐生葡萄球菌的相似度最高,为100%;系统发育树显示菌株JY08与腐生葡萄球菌腐生亚种(Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus ATCC 15305)聚为一支,结合全自动细菌鉴定仪生理生化特性鉴定结果和16S rRNA基因序列分析结果鉴定该菌株为腐生葡萄球菌。药敏试验结果表明,菌株JY08对β-内酰胺类、大环内酯类、磺胺类和林可霉素类等大类中的17种药物具有耐药性;对氨基糖苷类、喹诺酮类和氯霉素类等11种药物敏感;对多粘菌素B和呋喃唑酮2种药物中度敏感。耐药基因和毒力因子分析结果显示菌株JY08携带了10大类103个抗生素耐药基因和61种毒力因子123个相关毒力基因。本文研究结果为进一步评估该菌株潜在的具有感染能力的遗传特征提供科学数据,同时为该菌可能引起的疾病防控提供科学资料。     

患腹水病牙鲆病原菌分离、鉴定及病原菌的特性

为确定引起河北北戴河地区养殖牙鲆患腹水病死亡的病原,本实验从患腹水病牙鲆体内分离到3株优势菌,对分离株进行生理生化鉴定和16S rRNA序列比对来确定分离株的生物学地位,进一步通过毒力基因(toxR、vhhA、vhhB)鉴定及组织病理学分析其病理特征,并通过人工回感实验分析分离株毒性。结果显示,通过生理生化实验及16S rRNA序列比对,确定此次从患病牙鲆中分离到的3株菌株均为哈维氏弧菌;经鉴定,3株分离株毒力基因(toxR、vhhA、vhhB)结果均为阳性,病理组织切片结果显示,该分离株对牙鲆多器官(肠、肾脏、脾脏和肝脏)均可造成不同程度的病理损伤,呈全身性感染;人工回感实验显示,菌株BDHYPFS-Y1G对牙鲆的半致死浓度为LD50=5.88×106 CFU/mL,低于自然状态毒性;药敏实验表明,3株分离株均对呋喃妥因高度敏感。本实验确认了此次牙鲆腹水病的病原菌,并初步研究了病原菌致病性以及药物敏感性,以期为牙鲆工厂化养殖疫病防控提供科学依据。     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明,该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

鲤鱼细菌性败血症病原菌的研究

从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2 株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子、16S rRNA基因序列的测定及药敏试验,研究分离菌的生理生化特征、致病性及药物敏感性.根据2 株分离菌的菌落形态、生化特性和16S rRNA基因序列的测定结果(同源性为99%),确定为嗜水气单胞菌.人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又分离到该菌株.2 株菌对阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟等15 种药物均敏感,对氨苄西林均耐药,对复方磺胺表现出菌株差异.对其敏感的15 种药物可作为防治鲤鱼细菌性败血症的首选药物.     

海水网箱养殖许氏平鲉细菌性疾病病原鉴定及致病性研究

2019年8月,大连市金州区大李家街道海域海水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重的皮肤溃疡性疾病。以其为研究对象,从体表病灶、肝脏和肾脏上进行细菌分离,得到1株优势菌株BN-1910。为了验证网箱养殖许氏平鲉死亡是否由该菌株引起,采取腹腔注射的方式进行该菌株回感,以确定该菌株的致病力。在对菌株进行生理生化检验和形态学观察后,可以初步判断菌株为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。基于16S rRNA基因序列构建的分子系统发生树表明,哈维氏弧菌(MT864681.1)和该菌株在系统发育树中聚为一支,99%置信水平。研究结果显示,菌株BN-1910为哈维氏弧菌(V.harveyi),对许氏平鲉10 d的LD50为7.98×10^3 CFU/mL;对14种药物的敏感试验证实,菌株BN-1910对氟哌酸、链霉素和左氧氟沙星敏感。     

南移仿刺参体表溃疡症病原菌的分离鉴定及药敏分析

从福建省霞浦县网箱吊笼养殖的患病仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁中分离得到1株优势菌。人工感染实验证实该菌株为致病菌,经形态学、生理生化指标、16S rRNA序列分析和Biolog自动微生物鉴定系统鉴定,确定该病原菌为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。药敏试验表明,该病原菌对阿奇霉素、大观霉素、呋喃妥因、氯霉素、头孢吡肟、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮和复方新诺明等11种抗生素类药物敏感。     

广西牛蛙源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定、耐药性及组织病理分析

【目的】探明引起广西南宁市某养殖基地牛蛙（Rana catesbeiana）爆发疾病的病原及组织病理特性,为养殖牛蛙感染弗氏柠檬酸杆菌的诊断和药物防治提供参考依据。【方法】本研究从患病牛蛙肝脏,脾脏、肾脏、肠道中分离优势菌,采用形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列测定、系统发育学分析进行鉴定。为确定该菌株的致病机理,我们对该菌株进行了人工感染试验、组织病理分析、毒力基因检测、药物敏感性试验及耐药基因检测。【结果】从患病牛蛙的肠道中分离获得一株优势菌株(NFCF-02),经形态学观察、生理生化特性鉴定及16S rRNA序列分析,最终鉴定为弗氏柠檬酸杆菌。该菌株携带cfa、ompX、viaB等6种毒力基因,对牛蛙的半数致死浓度为3.09×106 CFU/mL,且临床症状与自然发病牛蛙的症状基本相同,如肝脏变黄、花肝、肝脏坏死;肾脏充血发红、胃表面有血丝以及肠道呈红色和血脓充塞肠道的症状。组织病理学观察发现其肝细胞变性坏死,肝索排列紊乱;肾小管上皮细胞肿胀坏死、严重区域肾小管崩解、坏死;脾脏中央静脉扩张淤血,含铁血黄素、色素细胞增多;肠黏膜脱落,肠上皮细胞坏死脱落,杯状细胞坏死。药敏试验结果表明分离菌株NFCF-02对新霉素、多粘菌素B、头孢拉定、多西环素4种抗菌药物敏感,对林可霉素和卡那霉素等14种抗菌药物已产生耐药性,携带gyrA、Sul1等7种耐药基因,表明该菌株已产生多重耐药性。【结论】弗氏柠檬酸杆菌对牛蛙具有高致病力,可引起肝脏和肠道等多器官组织的病理损伤最终引发机体的损伤甚至死亡。     

翘嘴鲌源维氏气单胞菌的分离鉴定及组织病理观察

为确定患病翘嘴鲌(Culter alburnus)的病原,本研究从患病鱼肝脏中分离到一株优势菌株CQ200825,对该菌进行形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA和gyrB基因序列分析、人工感染实验、毒力基因检测、组织病理观察以及药敏试验。结果显示,菌株CQ200825为短杆状的革兰氏阴性菌,通过16S rRNA和gyrB基因序列比对、系统进化树的构建和生理生化特性,确认为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。人工感染实验组与自然发病鱼都表现为鳍条基部出血、肝脾肿大、有腹水等症状,同时从人工感染濒死鱼体内分离到与菌株CQ200825理化及分子特性一致的优势菌株,表明CQ200825为患病翘嘴鲌的病原菌,并计算出菌株CQ200825对翘嘴鲌的半数致死量为2.7×106 CFU/mL。毒力基因检测结果显示,菌株CQ200825携带外膜蛋白(ompA)、溶血素(hlyA)、热稳定性肠毒素(ast)和细胞毒性肠毒素(act) 4种毒力基因。组织病理观察发现,患病翘嘴鲌的肝、脾、肾和肠均有不同程度的病变,即肝细胞肿胀、坏死,血管中血细胞凝集,脾脏红白髓界限不清、胞核有轻微肿胀,肾小管上皮细胞发生颗粒变性,肠绒毛大部分坏死脱落。药敏试验结果显示,菌株CQ200825对多西环素等17种抗菌药物高度敏感,对复方新诺明等4种抗菌药物中度敏感,对阿莫西林等12种抗菌药物表现为耐药。本研究可为翘嘴鲌维氏气单胞菌病的诊断与防治提供参考依据。     

珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)幼鱼溃疡病病原分离及鉴定分析

本研究对患溃疡病的珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)幼鱼进行病原分离和鉴定。从患病鱼分离到一株优势菌HW2018,回归感染实验证实其为致病菌。经形态学观察、16S rDNA以及生理生化等综合鉴定,菌株HW2018为弧菌属哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。3×10~(4 )cfu/g肌肉和腹腔注射,周死亡率均达到100℅。药敏分析结果显示,哈维弧菌HW2018对多种抗生素敏感,对碳青霉烯类的美罗培南、氟喹诺酮类的环丙沙星和左氧氟沙星尤为敏感;对氨苄西林耐药。     

凡纳滨对虾发光病病原的分离鉴定及防治措施

从广东某虾苗场患病虾苗体内分离到一株致病菌(D-1),回归感染实验证实该菌为虾苗发光病的致病菌.经BIOLOG细菌自动鉴定系统鉴定,该菌与哈维氏弧菌相似度最高(0.718),可利用的唯一碳源有乙酸、D-葡萄糖酸、麦芽糖、吐温、糊精等40种;采用通用引物扩增出该菌的16S rRNA片段,并进行了序列分析,结果表明,该菌的16S rRNA序列与哈维氏弧菌同源性最高(99.84％),且在系统发育树上与其聚成一簇.药敏实验结果显示,在60种抗生素中菌株D-1仅对菌必治、复方新诺明、先锋必、亚胺培南、舒普深等12种药物敏感,对青霉素G、氨苄西林、米诺环素、米罗沙星等35种药物有抗性.防治实例表明,0.2mg/L的舒普深能治愈发光率在10％以内的患病虾苗,治疗成活率为80％～ 90％.     

中国对虾糠虾幼体病原哈氏弧菌的鉴定及毒力基因检测

2011年春季对江苏连云港某对虾育苗场中国对虾Fenneropenaeus chinensis病死糠虾幼体分离到优势生长菌,对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及16S rRNA和gyrB基因同源性与系统发育分析。结果显示,引起糠虾幼体大量死亡的病原为哈氏弧菌Vibrio harveyi,菌株kx1对中国对虾仔虾和日本对虾仔虾的半数致死量LD50分别为2.0×106CFU/ml和7.0×105CFU/ml。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,进行了分离鉴定的4株病原菌对群体效应调节基因(luxR)、毒力调控基因(toxR)、溶血素基因(vhhA和vhhB)、金属蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、毒力相关基因(toxS)、鞭毛结构基因(flaA)及锌金属蛋白酶基因(pap6)共9种毒力基因的检测,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB和pap6毒力基因,扩增片段大小分别为679、390、1324、216和355 bp,其他4种毒力基因未检测到。分离鉴定的4株病原哈氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈氏弧菌的生物学标记。     

齐尔白鲑源嗜麦芽寡养单胞菌分离及16S rRNA基因鉴定

从发病齐尔白鲑(Coregonus nasus Pallas)的肾脏组织中分离到了1株优势菌QEBG-001,将分离纯化的菌株进行形态、生理生化特征研究和16S rRNA基因鉴定分析。结果显示,QEBG-001菌株的形态和生理生化反应结果符合嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的特征;16S rRNA基因序列分析结果显示,分离菌株在系统发育树上与嗜麦芽寡养单胞菌属同一分支,相似性达98%以上。综合菌株QEBG-001的形态学、生理生化试验及16S rRNA基因分析结果,将其鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌。药敏试验结果表明,分离菌株对利福平、美福仙(头孢西丁)、左氧氟沙星、氟苯尼考敏感性高。研究结果对养殖生产中用药预防和治疗被嗜麦芽寡养单胞菌感染的齐尔白鲑有实际指导意义。     

虹鳟源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)分离及16SrRNA基因鉴定

从发病虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肾脏组织中分离到了1株优势菌HZS-01,将分离纯化的菌株进行形态、生理生化特征研究和16S rRNA基因鉴定分析。结果显示,HZS-01株菌的形态和生理生化反应结果符合嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的特征。16S rRNA基因序列分析结果显示,分离菌株在系统发育树上与嗜水气单胞菌(A.hydrophila)属同一分支,同源性达99%以上。综合菌株HZS-01的形态学特征和16S rRNA基因分析结果,将其鉴定为嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明,分离菌株对强力霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、新生霉素、阿奇霉素敏感度高,对生产用药预防和治疗有实际指导意义。     

网箱养殖卵形鲳鲹“烂身病”病原分离鉴定及药敏分析

2016年5月,在海南临高和澄迈等深水网箱养殖区,养殖的卵形鲳鲹出现"烂身病",两周内鱼类大量死亡,对该产业带来较大冲击。针对海南省深水网箱养殖卵形鲳鲹"烂身病"进行调查分析,自患病鱼类肝脏中分离到1株优势菌株QT520,经回归感染试验确定其为病原菌。通过形态学、生理生化特征以及16SrRNA基因序列分析等综合鉴定,菌株QT520为弧菌属哈维弧菌,其单位质量半致死密度为2.5×105 cfu/(mL·g),属强毒菌株。药敏分析结果显示,哈维弧菌QT520对利福平、庆大霉素和多西环素等9种药物敏感,而对四环素、链霉素和卡那霉素等6种药物耐药。     

鲤病原鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及生物学特性研究

从患病鲤(Cyprinus carpio L.)体内分离到一株优势生长菌,人工感染试验证明该菌对鲤有较强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等生物学性状检验;测定了分离菌的16S rRNA和gyrB基因的部分序列,并与相关细菌16S rRNA和gyrB基因序列进行比对后,构建了基于两种基因的系统发生树。结果显示:分离菌所扩增的16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中鳗利斯顿氏菌的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上,其16S rRNA基因序列长度为1449 bp(GenBank登录号:FJ824662),gyrB基因序列长度为1202 bp(Gen-Bank登录号:GQ452957);胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌具有淀粉酶、蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有脂酶活性;在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上,呈β型溶血,分离菌均具有金属蛋白酶基因及溶血素基因。根据分离菌的表型特征及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell1986)的鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等12种药物耐药,对克林霉素等5种药物敏感,对恩诺沙星等32种药物高度敏感。     

秦皇岛地区克氏原螯虾源嗜水气单胞菌分离及生物学特征分析

为鉴定引起克氏原螯虾死亡的病原菌及分析其生物学特征,从秦皇岛地区病死的疑似细菌感染的克氏原螯虾的肝脏和胰腺分离出1株病原菌,暂定名为ProcQHD。经细菌分离鉴定和16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为嗜水气单胞菌。通过人工感染动物试验、PCR法及K-B药敏纸片对其致病性、毒力基因、耐药基因及耐药性进行了研究。结果表明,ProcQHD株的LD₅₀为1.0×10⁵ CFU/mL,携带ser、act、exu、lip和Luxs 5种毒力基因;ProcQHD株对替米考星、头孢曲松、环丙沙星、土霉素、诺氟沙星等12种药物高度敏感且携带Tet(A)、Tet(C)、Tet(E)、qepA、gyrB、aac4、aadB、Ant-Ia、Sul-1、LAP-1、SHV 11种耐药基因。分析发现ProcQHD株的某些耐药表型与耐药基因之间有一定相关性。     

大鲵源致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定和药物敏感性

为鉴定患病大鲵(Andrias davidianus)病原菌,从大鲵肠、胃、脾脏中分离得到菌株int1705,分离菌株经形态特征观察、生理生化特性测定、16S rRNA和aspC管家基因序列测定及系统发育学分析,鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。经人工感染,结果显示:菌株int1705能使健康大鲵发病并致死,半致死浓度(LD50)为3.16×10 6 CFU/mL,且发病症状与自然发病相似。药敏试验结果显示,菌株int1705对多粘菌素B、头孢他啶、诺氟沙星、氧氟沙星、复方新诺明等10种药物敏感。