菲律宾蛤仔二种I型溶菌酶的重组表达和抑菌活性

为研究病原微生物刺激后,菲律宾蛤仔I型溶菌酶的免疫应答反应,实验采用重组表达技术,从菲律宾蛤仔中得到2种I型溶菌酶的重组蛋白rVpILYZ-1和rVpILYZ-2,发现其均具有较为广谱的抑菌活性;其中,rVpILYZ-1对副溶血弧菌、灿烂弧菌和藤黄微球菌等具较强的抑菌活性,而rVpILYZ-2对副溶血弧菌抑菌活性较强,且二者均通过非酶抑菌活性和胞壁酸酶活性来发挥抑菌作用。结果显示,rVpILYZ-1最适pH和温度分别为6.5和20 ℃,而rVpILYZ-2最适pH和温度则分别为4.5和10 ℃。此外,rVpILYZ-1和rVpILYZ-2均具免疫调理活性,能够促进血细胞对病原菌的吞噬作用。研究表明,VpILYZ-1和VpILYZ-2在菲律宾蛤仔清除病原微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

青鱼生长激素在毕赤酵母中的表达

根据GenBank数据库中登记的青鱼(Mylopharyngodon picens)生长激素(bcGH)基因序列(AF389238)设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增青鱼生长激素cDNA编码区,并通过定向插入含强启动子AOX I的表达载体pPIC3.5k、电击转入毕赤酵母GS115菌株、G418多克隆子筛选和测序...     

毕赤酵母表达系统及其在水产领域的应用

主要阐述了毕赤酵母表达系统构成、特点及其在水产领域的应用现状。     

重组毕赤酵母SMD1168/pGAPZaA-VAP1稳定性及发酵表达WSSV-VAP1

研究发酵时间和接种量对WSSV-VAP1重组菌蛋白表达量的影响及重组毕赤酵母中外源基因的稳定性.结果表明,构建的重组菌SMD1168/pGAPZaA-VAP1在发酵72h后,蛋白表达量占总蛋白10.45%,控制接种量对基因工程菌Pichia pastoris表达WSSV-VAP1非常重要.外源基因的插入对宿主菌的生长未产生明显的影响,重组质粒在毕赤酵母SMD1168中很稳定.     

斑点叉尾NK-lysin成熟肽在毕赤酵母中的表达

NK-lysin是毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有抗菌作用的多肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。NK-lysin的生物学功能主要由其成熟肽(m NK-lysin)决定。本文在已有斑点叉尾(Ictalurus punctatus)NK-lysin成熟肽原核重组表达载体p ET-32a(+)-m NK-lysin的基础上,通过PCR在m NK-lysin的5’端和3’端分别添加EcoRI和Xba I酶切位点,并在3’端添加6×His标签以便于纯化;扩增到的片段与表达载体p PICZαA连接构建重组表达载体p PICZαA-m NK-lysin,转化至毕赤酵母X-33细胞中,通过博来霉素筛选以及对酵母转化子基因组的PCR鉴定得到高拷贝酵母转化子;在29℃,250 rpm,采用0.5%甲醇进行诱导表达;表达产物经固化金属离子亲和层析(IMAC)获得纯化的重组体m NK-lysin。经Tricine-SDS-PAGE分析,其分子量约为11.5 k D;经Western blot分析,证明m NK-lysin在毕赤酵母中成功表达。     

大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的重组分泌表达

依据大菱鲆红体病虹彩病毒（Turbot viral reddish body iridovirus,TRBIV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）基因序列,设计了一对特异性引物,并在正反向引物中分别引入EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点,从而将PCR扩增得到的TRBIV MCP基因双酶切后定向克隆到真核表达载体pGAPZαA的GAP启动子的下游位点,并电转化入大肠杆菌DH5α宿主菌内。经抗生素Zeocin筛选、PCR、EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切以及测序分析,构建了含有α-factor信号肽的真核重组表达载体pGAPZαA MCP。重组表达质粒pGAPZαA MCP经Avr Ⅱ单酶切后电转导入毕赤酵母X-33中,挑选阳性克隆,提取表达上清经SDS-PAGE和Western-blot免疫印迹分析。结果显示,TRBIV MCP基因在酵母中成功实现分泌表达。阳性重组酵母菌经过72h诱导培养后,重组TRBIV MCP的表达量高达60.2μg/ml左右。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因在毕赤酵母中的表达

白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是危害东南亚及北美洲沿岸养殖对虾的重要病原。近十年来,国内外对该病毒的形态结构、基因组全序列、宿主范围、传播途径、致病性和组织细胞特异性等作了大量的研究[1-7],并已确定该病毒的侵染与其囊膜蛋白vp28有关[8]。实验根据已发表的白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因序列[9]设计一对引物,通过PCR扩增出该囊膜蛋白的基因片段。将该片段连接到毕赤酵母表达载体pPICZ上,在大肠杆菌中筛选到含目的基因的重组质粒pPICZVP28,用电穿孔法将重组质粒转化到毕赤酵母菌株X33中,获得了转化子X33 …     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26的毕赤酵母组成型分泌表达

近年来,重组 VP28和 VP26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据GenBank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因,再用引物悬挂法将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到 VP28和 VP26基因的5￠端和3￠端。目的基因经双酶切后插入到表达载体pGAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化 X-33毕赤酵母感受态细胞,经 Zeocin 抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到VP28和VP26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载pGAPZαA组相比,VP28和VP26表达上清液组有明显的条带,证明VP28和VP26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的初步表达

根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

构建了枯草芽孢杆菌CH_2菌株(Bacillus subtilis CH_2)壳聚糖酶基因的真核表达载体p PIC9K-CH2-Cns,在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)中进行重组表达,获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶,对重组壳聚糖酶的酶学特性及酶解产物进行了分析。结果显示,重组壳聚糖酶的分子量为29 k D,粗酶的比酶活达到133.60 U/mg,纯化后重组蛋白的比酶活为338.08 U/mg;该酶的最适作用温度为50℃,最适pH为4.5,酶动力学常数Vmax=24.39(μmol/mg)·min~(-1),Km=5.48 mg/m L;Fe2+、K+等对其酶活力有一定的激活作用,其中Mn~(2+)能使酶活力提升2.4倍,Ag~+、Mg~(2+)、Hg~(2+)、EDTA、EGTA和SDS等存在时则对其酶活力有强烈抑制作用。利用重组壳聚糖酶酶解壳聚糖,酶解产物主要为聚合度2~10的壳寡糖,且分布均匀。以上结果表明,枯草芽孢杆菌CH_2菌株壳聚糖酶基因在毕赤酵母GS115中成功表达,获得了一种内切型的高酶活力重组壳聚糖酶,该重组酶具有反应条件温和、酶解产物均一等特点,可被应用于海洋甲壳质加工应用中。     

N-端缺失突变核糖核酸酶抑制因子在毕赤酵母中的克隆与表达

人胎盘核糖核酸酶抑制因子(HRI)是一种存在于细胞浆中的50kDa的酸性蛋白质,富含亮氨酸和半胱氨酸。作为胞浆蛋白可保护细胞不受外来的胰RNase的侵袭,同时做为RNase抑制剂在各实验室广为应用。HRI主要结构是由7个富含亮氨酸的重复序列组成,7个亮氨酸重复单位有规律环状排列使N-末端、C-末端在空间上较为接近。本文用PCR的方法在HRIcDNA5'端去除30个碱基,并将此缺失突变的HRI的cDNA片段构建于质粒pPIC9K,PCR和双酶切鉴定结果为阳性,测序结果证实在HRIcDNA5'端成功引入30个碱基的缺失突变。电击转化入毕赤酵母(Pichiapastores)GS115中,进行分泌型表达。对表达产物进行亲和层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot免疫印迹杂交,证实表达产物为N-端缺失突变的核糖核酸酶抑制因子。     

玉米蛋白粉替代鱼粉对暗纹东方鲀溶菌酶活性及c型溶菌酶mRNA表达的影响

以初重为(41.26±1.09)g的暗纹东方鲀为实验鱼,配制5种玉米蛋白粉使用量为0%、5%、10%、15%、20%的实验饲料,玉米蛋白粉对饲料中鱼粉的替代水平分别为0%、7.4%、14.8%、22.2%和29.6%。用实验饲料饲养暗纹东方鲀60d,研究玉米蛋白粉替代鱼粉对暗纹东方鲀肝胰脏、头肾和脾脏组织的溶菌酶活性及其c-型溶菌酶mRNA相对表达量的影响。结果表明,(1)暗纹东方鲀肝胰脏、头肾和脾脏的溶菌酶比活力分别为9.14、42.12和40.49U/mgprot,头肾和脾脏组织中c-型溶菌酶mRNA相对表达量分别是肝胰脏的3.76和3.24倍。(2)玉米蛋白粉替代鱼粉显著影响暗纹东方鲀溶菌酶比活力。5%和10%组的肝胰脏和头肾组织溶菌酶比活力显著高于对照组(P<0.05),而15%和20%组肝胰脏和头肾组织溶菌酶比活力则显著低于对照组(P<0.05);5%和10%组的脾脏组织溶菌酶活力与对照组无显著性差异(P>0.05),而15%和20%组显著低于对照组和5%组(P<0.05)。(3)玉米蛋白粉对暗纹东方鲀c型溶菌酶基因mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)。肝胰脏组织中5%和10%组表达量显著高...     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究

根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。     

中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal)的重组表达及活性分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过精确调控丝氨酸蛋白酶的活力,在生物体的防御应答等众多生物过程中发挥重要作用。以前期克隆的中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal, GenBank注册号为DQ318856)为基础,对其功能结构域进行序列比对和进化分析;组织表达分析结果表明,该基因在血细胞、鳃和淋巴器官等组织中高水平表达,而在眼柄、神经和肌肉中无表达;利用原核表达系统对该基因成熟肽区域成功进行了重组表达,纯化后的目的蛋白最终得率为0.4 g/L培养液;活性分析结果显示,复性后的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑气单胞菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑菌作用。     

中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的重组表达及活性分析

Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能方面发挥着重要作用。我们在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin, GenBank注册号：DQ318857）,初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒（WSSV）引发的对虾先天免疫应答反应;本研究利用原核重组表达系统,成功获得了重组的对虾serpin型蛋白酶抑制剂（rFc-serpin）,纯化复性后得率为0.3g/L;活性分析显示,重组目的蛋白（rFc-serpin）对多种病原菌的生长均有一定抑制作用,研究结果进一步证实它参与病原微生物引发的对虾防御应答过程,为探讨甲壳动物先天免疫防御应答机制提供了有价值的参考。     

中国明对虾C 型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析

研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。     

长丰鲫c型溶菌酶基因的克隆及其在细菌感染条件下的表达分析

为了解c型溶菌酶基因与长丰鲫(Chang Feng Carassius auratus)的抗菌效应关系,本研究利用同源克隆方法获得长丰鲫c型溶菌酶基因cDNA全长序列。结果显示:c型溶菌酶基因全长698 bp,包括5'端非翻译区60 bp,3'端非翻译区200 bp,开放阅读框438 bp,编码145个氨基酸。长丰鲫c型溶菌酶基因在肾脏组织中表达量最大,在脾脏、肠道、心脏和脑中大量表达,在肝脏和鳃中表达量相对较低,在皮肤和肌肉中几乎不表达。长丰鲫在感染迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌后,在肝脏、肾脏、脾脏和鳃等组织中基因表达量均发生显著变化,出现不同程度的上调。感染迟钝爱德华氏菌后,在脾脏中的上调幅度最大,其次为鳃、肝脏和肾脏;感染嗜水气单胞菌后,在脾脏中上调程度最大,其次是鳃;感染金黄色葡萄球菌后,在脾脏中上调幅度最大。在肝脏和肾脏中,经金黄色葡萄球菌刺激后c型溶菌酶基因的上调幅度最高;在脾脏和鳃中,经嗜水气单胞菌感染后c型溶菌酶基因上调幅度最高。三种刺激后,c型溶菌酶基因升高幅度的不同,说明不同刺激使鱼体组织产生的应激反应能力不同。     

IGF-Ⅰ及其受体基因在牙鲆胚胎发育过程中的表达图式

胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ)是脊椎动物生长发育的重要调控因子,其生物学功能主要通过与其特异的膜受体(IGF-Ⅰ receptor,IGF-IR)结合而调节.因此,IGF-Ⅰ及其受体表达特征的分析对于阐述IGF系统调控的发育过程具有重要的意义.本研究采用荧光实时PCR方法,以不同发育时期的牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎为材料,分析了胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其两种受体基因在鱼类胚胎发育过程中的表达图式.结果显示,牙鲆IGF-Ⅰ、IGF-IR-1和IGF-IR-2基因均有母源转录本,且各基因的表达在胚胎发育的不同阶段具有明显的发育性变化.IGF-Ⅰ基因在早期胚胎发育阶段仅有少量的mRNA存在,而合子基因的表达在晶体出现至出膜前阶段逐步增加.两种IGF-Ⅰ受体基因则展现出迥然不同的表达时序.IGF-IR-1基因在受精卵、卵裂及囊胚期的早期胚胎发育中有相对较少的转录本,至原肠期其合子基因强烈表达,且在神经胚、晶体出现、心跳和出膜前各阶段均有高量的表达;相反,IGF-IR-2基因在受精卵至原肠期的早期胚胎中有丰富的转录本,但合子基因的表达在后期胚胎形成中却相对降低,暗示了二者可能在调节牙鲆胚胎发育中起着不同的作用.     

重组Hu-IFN-α基因在草鱼中的整合和表达

采用显微注射法将人α干扰素(HuIFNα)重组基因转入草鱼Ⅰ～Ⅱ细胞期的受精卵,然后对转化培育出的草鱼个体提取血液总DNA进行PCR和Southern杂交检测及ELISA检测,以研究重组基因在受体基因组上的整合和表达情况。实验结果显示:HuIFNα重组基因能整合在草鱼基因组上,但其整合是随机的,整合位点没有固定区域,而且整合在受体草鱼基因组上的HuIFNα基因的表达率较低,表达水平在个体间有很大差异。大部分转基因个体外源基因表达水平集中在39～74pg/mL之间,表达最高个体HuIFNα浓度为1450pg/mL。