黄瓜CsHIR1基因表达载体的构建及遗传转化

为了优化黄瓜遗传转化体系以及研究CsHIR1基因在黄瓜中的功能特性,本试验利用In-fusion技术构建植物表达载体pCAMBIA35S-CsHIR1,经过限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ双酶切检测、质粒PCR检测和测序鉴定,结果表明,表达载体pCAMBIA35S-CsHIR1已构建成功并转入农杆菌GV3101中。以黄瓜抗病种质‘PI197088’和感病种质‘CCMC’的子叶节为外植体,通过优化的农杆菌介导法初步将CsHIR1基因转入黄瓜中,经PCR检测获得25株阳性植株,其中8株阳性植株自交得到种子T1代,T1代PCR检测阳性率为44.7%,实时荧光定量分析表明CsHIR1在T1代阳性株中的相对表达量稍高于对照植株,有1株与对照组的差异较显著,这为进一步研究CsHIR1在黄瓜中的功能奠定了基础。     

Cry2A基因植物表达载体构建及其转化子生长曲线的建立

根据定向克隆原则,以pCAMBIA2301为载体骨架,Cry2A基因为目的基因,构建了大小为15354 bp的植物表达载体p2AST2301。新载体带有抗虫基因Cry2A和筛选标记基因NPTⅡ,适合通过农杆菌进行遗传转化,并以抗生素G418为筛选底物。同时将新载体转化根癌农杆菌EHA105,获得了用于植物遗传转化的工程菌,并且明确了工程菌D600 nm值在1.0-1.6之间活力最强。     

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR.     

普通烟草IRL基因反义植物表达载体的构建

异黄酮还原酶相似蛋白(IRL)是与异黄酮还原酶具有高度序列同源一致性而功能不同的一类蛋白.通过PCR扩增普通烟草(Nicotiama tabacum)品种龙里红花烟IRL基因的一段特异保守片段NtIRLA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了IRL反义植物表达载体pCAMBIA2301G-IRLA.通过PCR鉴定、酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株,为进一步利用转基因手段明确IRL基因在烟草次生代谢中的功能奠定了基础.     

转基因表达有机磷水解酶(OPH)提高黄瓜降解蝇毒磷能力的初步研究

为快速提高黄瓜降解有机磷农药残留的能力,选取能广泛降解有机磷农药的有机磷水解酶(OPH)为表达蛋白,构建CaMV 35S启动子驱动有机磷水解酶基因(opd)的植物表达载体pSOP,经双酶切证明重组载体含有插入位置和方向皆正确的目的片段。通过农杆菌介导遗传转化黄瓜子叶节,诱导和筛选出9株抗性苗,获得3株GUS染色和PCR阳性转化苗。酶活性分析表明,转基因黄瓜降解蝇毒磷能力是对照(非转基因株)的4.7~9.7倍,最高达到7.8μmol/(mg.min),有助于加快降解黄瓜中的有机磷农药残留,为食品安全研究提供借鉴。     

GPAT基因表达载体的构建及对非洲菊的遗传转化

运用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶(GPAT)基因构建表达载体,将GPAT和QS115质粒中的诱导型启动子串联后,插入带有终止子PinⅡ的表达载体pCAMBIA1300质粒中。并用PCR和酶切等多种方法进行鉴定。构建后的载体经PCR和酶切鉴定表明目的基因和启动子均已按预计方式插入载体的指定位置。用农杆菌介导的方法将它们转化到非洲菊中,获得了潮霉素的抗性植株,并通过PCR扩增验证,有抗性苗含有这个抗冷基因。     

甘蓝型油菜F3’H基因反义植物表达载体的构建

类黄酮3’-羟化酶(F3’H)是类黄酮途径中的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。通过PCR法扩增了甘蓝型油菜(Brassica napus L.)F3’H基因的一段特异保守片段F3’HA,并将其亚克隆到中间载体pCAMBIA2301G中,构建了F3’H反义植物表达载体pCAMBIA2301-F3’HA,通过PCR鉴定和酶切鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。为进一步研究F3’H基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和该基因的代谢调控网络奠定基础。     

甘蓝型油菜透明种皮12（TT12）基因家族反义抑制植物表达载体的构建

【研究目的】构建一个同时反义共抑制甘蓝型油菜(Brassica napus)透明种皮12基因家族(BnTT12)转录的植物表达载体。【方法】通过PCR扩增得到BnTT12家族一段503bp的特异保守片段TT12A,通过亚克隆整合到中间载体pCambia2301G,构建TT12反义植物表达载体pCambi-a2301G-TT12A。采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌。【结果】经过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成TT12反义表达载体的工程菌株。【结论】pCambia2301G-TT12A的成功构建为利用此反义载体通过遗传转化获得转基因新型黄籽油菜和进一步探明TT12基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理奠定了基础。     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。     

甜瓜T-DNA插入突变体的构建

[目的]构建激活标签载体并将其转入甜瓜中,获得甜瓜T-DNA插入突变体,为甜瓜功能基因组学的研究奠定基础.[方法]用PCR法扩增目的DNA片段,经EcoRI和SacI顺序酶切,将目的片段连接到pCAMBIA2301载体上,构建含4 ×35s Enhancer DNA片段的激活标签载体.以甜瓜品种‘伽师’为材料,利用农杆菌介导的转化体系转化甜瓜愈伤组织,获得甜瓜T-DNA插入突变体.[结果]获得4株T0代甜瓜转化幼苗,通过Kan筛选和PCR鉴定甜瓜转化幼苗的DNA中是否含有目的基因,证明其中3株甜瓜转化幼苗为转基因植株.[结论]获得了突变植株,为甜瓜重要性状基因发掘奠定基础.     

橡胶树HbHMGR1基因克隆及其愈伤组织转化

[目的]克隆橡胶树HbHMGR1基因,转化橡胶树易碎愈伤组织,为橡胶树遗传转化和品种改良打下基础.[方法]根据已经报道的HbHMGR1基因序列（NCBI登录号X54659.1）设计特异引物,通过RT-PCR克隆HbHMGR1基因,构建pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1植物表达载体.再用EHA105（携带pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1,内含NPTⅡ和uidA基因）侵染橡胶树易碎愈伤组织,数月筛选后对抗性易碎愈伤组织系进行GUS染色和分子检测.[结果]成功克隆了HbHMGR1基因,双酶切重组质粒、重组质粒的PCR扩增结果证明成功地构建了该基因的植物表达载体pCAMBI-A2301-35S-HbHMGR1.侵染后抗性橡胶树易碎胚性愈伤组织GUS检测为蓝色,且分子检测呈现阳性,共获得15个抗性易碎愈伤组织系.[结论]橡胶树HbHMGR1基因在愈伤组织阶段开始表达,有效提高了HbHMGR1基因在橡胶中的表达量.     

抗Ⅰ型糖尿病融合基因HSP65-6×P277在烟草中的表达

为了研究抗Ⅰ型糖尿病融合蛋白质基因HSP65-6×P277在植物中的表达,构建了含有融合基因HSP65-6×P277的植物表达载体pCAMBIA2301-HSP65-6×P277,通过农杆菌介导法将重组载体转入烟草,利用卡那霉素作为植物筛选标记,获得含有抗Ⅰ型糖尿病基因的16株转基因烟草植株。通过PCR、半定量RT-PCR及SDS-PAGE蛋白质电泳等方法检测,初步验证在抗性烟草植株中融合基因HSP65-6×P277在mRNA和蛋白质水平上进行了表达。     

黄瓜(Cucumis sativus L.)离体再生和转化体系的优化

以黄瓜4d苗龄子叶节和农杆菌GV3101为实验材料,对再生体系和转化体系条件进行优化。再生部分,将培养基中的6-BA和ABA设立浓度梯度,并添加适量的AgNO3,进行再生情况对比,得最佳配方MS+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L ABA+2.0mg/L AgNO3,可直接诱导出芽,最短45d获得完整植株。转化部分,根据敏感性试验确定选择培养卡那霉素(kan)筛选压,并运用gus瞬时表达法对预培养时间、侵染时间、共培养时间和抗氧化剂的添加等影响转化效率的因素进行优化。结果表明,50mg/L kan筛选压即可筛选出阳性株;预培养时间1～2d,侵染时间20～30min,共培养3d时转化效率较高;抗氧化剂的加入可显著提高转化效率。对该转化体系进行验证,PCR结果初步表明外源基因成功整合入黄瓜基因组中。     

农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立与优化

以“中苜一号”紫花苜蓿品种作为受体材料,建立了适用于农杆菌介导的转基因组培体系,并对GUS 基因进行转化,经 GUS 组织化学染色,以获得抗性愈伤组织分析为目的,转化优化条件为:叶片预培养 4~5 d,用农杆菌菌液(A600=0.3~0.8)侵染 20 min,然后在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养 7 d 后清洗。     

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化

【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPT Ⅱ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种“优引三号”,对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立

根据genebank中公布的pmi基因序列设计引物,通过PCR扩增从大肠杆菌中分离出6-磷酸甘露糖异构酶基因。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素抗性基因hpt,构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI。对水稻进行了基因枪转化和农杆菌转化,研究了筛选培养基中甘露糖浓度对抗性愈伤组织频率的影响。部分抗性愈伤组织已获得再生植株,PCR检测初步证明外源基因已转入植物细胞。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

开花调控基因BpMADS4无抗性表达载体的构建

为了构建含有报告基因GFP基因和BpMADS4基因的无抗性双元表达载体pCAMBIA1302-GFP-Bp,参考已发表的欧洲白桦（Betula pendula）开花调控基因（BpMADS4）序列,利用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从欧洲白桦的幼嫩花序中克隆得到促进开花的BpMADS4基因。将该基因替换pCAMBIA1302载体中的潮霉素抗性基因,构建含有报告基因GFP基因和BpMADS4基因的无抗性双元表达载体pCAM-BIA1302-GFP-Bp。结果表明：成功构建了无抗性双元表达载体pCAMBIA1302-GFP-Bp。该表达载体在苹果遗传转化中不使用抗生素筛选,可以解决抗生素抗性筛选降低苹果转基因转化效率的问题以及转基因苹果中选择标记基因造成的生物安全性问题,用该载体转化苹果可以缩短苹果童期,有效提高其育种效率。本研究为筛选对环境安全的、具有易成花特性的苹果新种质奠定了基础。