基于iTRAQ技术伪狂犬病毒感染宿主细胞差异表达蛋白质组分析

为了研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞后宿主蛋白的差异表达情况,寻找PRV与细胞相互作用的重要分子,本试验将PRV接种PK-15细胞,运用同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合色谱/串联质谱联用技术,开展病毒感染细胞后差异表达蛋白分析,并通过qPCR对其数据进行验证。以未接毒细胞为对照,通过数据库检索,分析出3 062个蛋白,共鉴定到27个差异表达蛋白,其中21个蛋白下调,6个蛋白上调。这些差异蛋白主要参与代谢过程、生物调控、应激反应以及定位等生物学过程,具有结合活性、催化活性、转录活性等分子功能。NFκB1、PIK3R2、HSPA1L等差异蛋白在多条通路中发挥作用。POP1、UTP15和ND4的表达变化情况与iTRAQ结果变化趋势一致,证明了该数据的可靠性。本试验研究结果为进一步研究PRV致病机制及宿主免疫应答提供理论依据。     

猪伪狂犬病毒gE基因在大肠杆菌中的表达

根据Genebank中伪狂犬病毒Min-A株gE基因序列,设计了一对引物,PCR扩增长度为557bp的gE基因去信号肽后的主要抗原区域(157-714bp),将其克隆进测序载体PGEM-Teasy中,成功构建质粒PGEMTeasy-gE。用BamhI和HindIII将gE基因主要抗原区域从PGEM-Teasy中切出,然后与同样酶处理的原核表达载体PET32A连接,命名为PET-gE。在IPTG的诱导后,经SDS-PAGE电泳发现43ku处出现特异性蛋白条带。经过Western blot分析,表达产物具有很好的免疫原性。该研究成功表达出具有抗原性的目的蛋白,为血清学鉴别诊断方法gE-ELISA的建立打下很好的基础,同时gE-ELISA也能对野毒和疫苗毒进行鉴别。     

表达口蹄疫病毒3AB基因的伪狂犬病毒载体的构建

为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。     

伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。     

山羊感染伪狂犬病毒的诊断

伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物易感的急性、败血性传染病,近几年国内陆续有羊感染伪狂犬病毒的病例报告。2013年3月,青海省某养殖户饲养的青海山羊发生了以体温升高、厌食、精神沉郁、剧痒为主要特征的疾病,通过临床症状观察,病理剖检以及血清学和分子生物学等实验室诊断,最后确诊发病山羊由伪狂犬病毒感染所致。建议加强对山羊伪狂犬病毒的诊断及监控。     

伪狂犬病毒gB基因的研究进展

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)主要感染猪,能够引起感染动物的死亡和流产,给世界养猪业带来了严重危害。随着分子生物学的发展,伪狂犬病毒的研究取得了显著进展。综述了PRV的主要保护性抗原基因g B的结构特点和功能研究进展以及其编码的糖蛋白g B在PRV疫苗研究和伪狂犬病防控研究中取得的进展。     

猪场伪狂犬病毒的净化

对猪场伪狂犬病毒的净化是一个系统工程,可从做好生物安全、固定技术人员以及疫苗注射、淘汰阳性猪只等方法做好净化工作。     

伪狂犬病毒Ea株UL38基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL38全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL38基因全长1 107 bp,可编码369个氨基酸.将该基因克隆到原核表达载体pQE-82L的6×His下游,获得原核表达质粒pQE-UL38,IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达并获得相对分子质量约40 000的融合表达蛋白6×His-UL38,Western blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL38基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL38,转染Hela细胞,24、48 h通过激光共聚焦显微镜观察显示pEGFP-UL38,24 h荧光主要分布在胞浆,有部分分布在核内,但随时间延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后48 h几乎完全定位于核内.但对照载体pEGFP-N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞.     

伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gC的研究进展

伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）感染能够引起猪的大面积死亡,给养猪业造成巨大损失,减毒活疫苗和灭活疫苗被广泛使用于猪的伪狂犬病防治。PRV的囊膜糖蛋白gC基因（gC）是病毒增殖所非必需的基因,但是缺失gC基因的PRV不能有效地黏附靶细胞表面。通过综述PRV的囊膜糖蛋白gC的结构和功能,以及gC蛋白在疫苗研制中的应用,为伪狂犬病的防控提供依据。     

猪伪狂犬病毒PCR检测方法的优化

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种疱疹病毒性疾病,在世界大部分地区都是地方性家畜流行病。而且猪伪狂犬病与其他猪传染病不易区分,因此,建立一个特异性强的检测方法对于其诊断具有重要意义。实验是在实验室已经建立伪狂犬病毒单项PCR检测方法的基础上,对扩增条件进行优化后对其特异性进行了验证。结果发现,优化后的方法特异性好,只有猪伪狂犬病毒扩增为阳性,其余DNA病毒:猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)均呈现阴性。因此,本研究方法可以为今后实验室检测猪伪狂犬病毒提供参考。     

猪伪狂犬病毒的分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒.该病毒接种的Balb/c小鼠出现神经症状,死亡率为60%,接种PK-15细胞出现拉网病变,猪的狂犬病毒阳性血清能特异性的中和该分离毒.根据基因库(genebank)的PRV gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,结果证实该病毒为伪狂犬病毒.     

猪伪狂犬病毒分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒.该病毒接种Balb/c小鼠出现神经症状,死亡率为50%,接种Vero出现拉网病变;伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)阳性血清能特异中和该分离毒;根据基因库(genebank)的PRV gD基因(AY169694)设计的引物能扩增出特异性片段.以上结果证实该病毒为伪狂犬病毒.     

伪狂犬病毒单克隆抗体的制备和鉴定

以伪狂犬病毒（PRV）作为免疫原,免疫BALB／c小鼠,融合之后经间接ELISA、IFA和IHC试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRV单克隆抗体（简称单抗）的杂交瘤细胞株。2株猪伪狂犬病毒单抗与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒均无交叉反应,IFA结果显示单抗能与接种于猪睾丸细胞（ST）的PRV发生特异性反应,IHC结果显示单抗能用感染了PRV的猪神经组织发生反应,证实抗PRV单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,此结论为猪伪狂犬病毒抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建

设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。     

伪狂犬病病毒gD、gE基因的克隆及转移载体的构建

利用PCR扩增了伪狂犬病病毒Min-A株gD、gE基因,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.将gD、gE基因连接于质粒pUC18获得pUgDgE,缺失质粒pUgDgE的BamHI和BstEII位点间391bp的片段.在此缺失位置插入来自质粒pcD-NA3.1-的一段含hCMV启动子、多克隆位点和Neo报告基因的片段,构建了通用转移载体pgD-M-gE.该转移载体缺失了伪狂犬病病毒gI基因和gE基因ORF5'端363bp的碱基,有11个酶切位点可供外源基因的插入,上下游侧翼分别为1.25bp和1.42bp.这为开发以伪狂犬病病毒为载体的多价基因工程疫苗提供了有力工具.     

快速诊断伪狂犬病毒的LAMP方法的建立

采用LAMP技术建立了一种针对伪狂犬病毒的可视、快速、灵敏、特异的检测方法。应用PrimerExplorerV4软件,根据伪狂犬gE基因的保守序列设计了4条引物,优化了反应体系与反应时间,检测了特异性与灵敏性。发现该方法只需要40 min就能检测出结果,具有良好的特异性,灵敏度为普通PCR的100倍,最低可检测出质量浓度为6.2×10-9mg/L的病毒DNA。该方法的建立为伪狂犬病的快速诊断提供了新的思路。     

猪伪狂犬病毒的流行特点与防控

猪伪狂犬病是危害养猪业较严重的病毒性传染病,病原为猪伪狂犬病毒,该病主要导致妊娠母猪流产,产死胎和弱仔,仔猪感染后有很高的死亡率。本文主要介绍猪伪狂犬病的流行特点与防控措施,为基层养猪场猪伪狂犬病毒的防控提供参考。