FMDV OA/58病毒株VP1蛋白结构构建与B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR Ⅰ酶切法鉴定.运用同源模建得到OA/58 VP1蛋白3D结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,预测OA/58 VP1的抗原表位.结果 OA/58 VP1存在多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:2～11,15～35,38～50,77～88,90～107,121～125,131～135,140～149,154～163,169～175,178～189,197～213.应用同源模建得到的OA/58 VP1蛋白3D模型来预测其B细胞表位,为进一步研究OA/58 VP1功能,构建突变体和选择表达新型OA/58 VP1蛋白分子提供有参考价值的信息.     

FMDV OA/58病毒株VP3蛋白结构的模拟与分析

以口蹄疫病毒株OA／58 RNA为模板，反转录并扩增目的cDNA，然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株，提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和BarnHⅠ、HindⅢ双酶切法鉴定。分析表明，口蹄疫病毒VP1、VP2、VP3和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的（P〉0．05）；而它们在氨基酸水平上的变异率差异显著（P〈0．05）。该毒株与20株源于GenBank中的VP3氨基酸序列比较发现其保守区主要位于第1～24、26～35、37～43、45～57、61～122、124～173、175～209、211～220位。运用同源模建，OA／58 VP3蛋白三维空间结构可分为A，B，C3个结构区域。保守区氨基酸残基在维持VP3蛋白的空间构象和功能方面具有重要作用。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1上B细胞表位的筛选鉴定

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72 VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据.     

口蹄疫病毒株AF72 VP2的结构模拟与分析

为了分析FMDV AF72VP2蛋白结构和功能的关系.以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增目的基因,PCR纯化产物与pGEM-Teasy载体连接并转化JM109菌株,用凝胶电泳、PCR和SpeⅠ、SphⅠ双酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序.比对测序结果确定AF72 VP2的核苷酸序列,利用同源建模的方法建立AF72 VP2结构蛋白的3D结构,在此基础上,综合亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数预测AF72 VP2结构蛋白的B细胞抗原表位.分析表明,口蹄疫病毒VP1,VP2,VP3 和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的(P>0.05);而他们在氨基酸水平上的变异率差异显著(P<0.05).该毒株与20株源于GenBank中的VP2氨基酸序列比对发现其保守区主要位于第1～23、37～51、66～76、85～101、124～142、165～199、205～219位.保守区氨基酸残基在维持VP2蛋白的空间构象和功能方面具有重要作用,其中1～10、129～140、165～176氨基酸区段是AF72 VP2结构蛋白可能的B细胞抗原表位区域,该结果将为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供更有价值的参考信息.     

FMDV Asia1/HeB病毒株结构蛋白基因的克隆测序及B细胞抗原表位预测

对口蹄疫病毒Asia1/HeB株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定.采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行分析,综合预测其B细胞表位分布.结果表明,FMDV Asia I/HeB株P1基因长2 199 bp,包含完整的开放阅读框,编码733个氨基酸,其中VP1长633 bp,编码211个氨基酸,VP2长654 bp,编码218个氨基酸,VP3长657 bp,编码219个氨基酸,VP4长255 bp,编码85个氨基酸.P1结构蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的β片层结构和转角结构,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞优势表位,VP4上也有少量的潜在B细胞表位.与已鉴定的B细胞表位相比较,该方法预测的结果有较高的准确度.为试验确定FMDV AsiaI/HeB株P1结构蛋白的B细胞表位和反向疫苗学设计提供了理论基础.     

类猪圆环病毒因子P1 VP2蛋白二级结构与B细胞表位预测

旨为预测类猪圆环病毒因子P1 VP2蛋白的B细胞表位.采用生物信息软件和互联网服务器,预测VP2的二级结构,分析VP2表面特性(亲水性、可塑性、可及性和抗原性),综合预测VP2的B细胞抗原表位.结果表明,P1 VP2蛋白肽链的6-18和80-92区段为预测的B细胞表位优势区.多参数方案综合预测P1 VP2蛋白的B细胞抗原表位,为进一步鉴定表位及设计疫苗奠定了基础.     

口蹄疫病毒株AF/72结构蛋白VP1克隆及其T细胞表位预测

以 AF/72 RNA 为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy 体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR 和EcoR I 酶切法鉴定.应用BIMAS生物学软件对AF/72株结构蛋白VP1的H-2Dd、H-2Kd、 H-2Ld、 A20限制性T细胞表位进行预测,并对不同限制性的T细胞表位进行对比.结果表明,口蹄疫AF/72株结构蛋白VP1长639 bp,编码213个氨基酸.不同限制性的T细胞表位虽然不尽相同,但与已鉴定的T细胞表位相比较,它们之间也有一些类似的、并且可能是通用型的T细胞表位.本试验通过生物信息学方法预测AF/72结构蛋白VP1的T细胞表位,为进一步试验确定T细胞表位和口蹄疫病毒T细胞表位的研究提供了一种有效的方法.同时为口蹄疫病毒表位疫苗的设计提供有效地理论基础.     

携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究

为了研究RHDV病毒样粒子作为载体提呈外源B细胞表位的能力,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,构建携带FMDV B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa)的VP60嵌合蛋白,研究外源基因对VP60蛋白的表达、病毒样颗粒(VLPs)的装配及免疫原性的影响。分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入外源B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。经IFA、SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定嵌合蛋白的表达,通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病毒样颗粒的能力,通过动物试验研究其免疫原性。结果显示,嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,可自聚形成病毒样颗粒,免疫小鼠后可以产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。该研究为嵌合VP60 VLPs的形成及结构功能的研究奠定基础,同时为RHDV-VLPs作为外源B细胞表位展示载体的可行性提供依据。     

猪附红细胞体ORF4蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测

为了预测猪附红细胞体(Mycoplasma suis)ORF4蛋白的空间结构和B细胞抗原表位。选择Genebank序列号AJ504999中ORF4基因,应用生物信息软件和互联网在线程序分析ORF4的氨基酸序列预测二级结构、三级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数及表面可及性。结果表明：ORF4蛋白二级结构没有α-螺旋,其中柔性结构以β-转角为主,潜在的优势B细胞抗原表位区段主要分布在28~34,54~61氨基酸区段。本研究预测了ORF4蛋白空间结构和B细胞抗原表位,为猪附红细胞体表位疫苗的设计研发提供了指导意义。     

RHDV VLPs单克隆抗体的制备及其识别表位的初步定位

为了筛选兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)的特异性单抗,并进一步分析单抗识别表位的分布情况,将重组杆状病毒r Ac V-Bac-VP60接种Sf9昆虫细胞,收获细胞培养物,电镜观察显示重组VP60蛋白获得有效表达,并可组装成病毒样粒子(VLPs)。将RHDV VLPs作为免疫原与等量弗氏佐剂乳化,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次亚克隆后,获得11株能稳定分泌抗RHDV VLPs抗体的阳性杂交瘤细胞株。间接ELISA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,这11株单克隆抗体均能够特异地识别RHDV VLPs和天然RHDV。11株单抗均为Ig G1,其中1D4和3F7的轻链为Lambda型,其余均为Kappa型。截短表达结果显示,单抗5A3针对RHDV VP60的NTA区,5F3针对RHDV VP60的S区,单抗1B8、1D4、3D11、3F7、4C2、4G2、5G2、5H3和6B2针对RHDV VP60的P区。研究为RHDV VLPs抗原表位的鉴定和RHDV结构功能的研究奠定了基础,同时为RHDV的检测和新型疫苗研究提供物质基础。     

口蹄疫病毒株OA/58 L蛋白酶的结构构建和功能分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR I酶切法鉴定。该毒株与A12,O1K,O1Campos和TW45/97毒株序列通过对比分析发现,L基因中有2个起始密码子,第二个是首选;并且确定氨基酸保守区主要位于第35～39,43～54,65～67,75～80,90～111,113～142,144～146,148～157,159～172和176～187位。L蛋白酶含有球状区域,碳端有一柔性杆状结构。合成的L蛋白酶可形成二聚体结构。第144位的Lys、148位的His和163位的Asp可能是L蛋白酶的活性位点。保守区氨基酸残基在维持蛋白的空间构像和功能方面具有重要作用。由拉马钱德兰图可证明本试验构建L蛋白酶的空间结构是合理的,它对于进一步的研究具有指导性。     

口蹄疫病毒株OA/58 3C蛋白酶的结构模拟和功能分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-TEasy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定。该毒株与Poliovirus,Hepatitis Avirus和Human rhi-novirus 89毒株3C序列对比分析发现核苷酸序列一致性分别为38.8%,37.1%和36.5%,氨基酸序列一致性分别为23.7%,19.2%和17.6%。通过Swiss-pdbViewer软件模拟出FMDVOA/58 3C蛋白酶的3D结构和表面模型。并鉴定出此毒株3C蛋白酶的活性中心为Cys31-His46-Asp84。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达

文章旨在利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。     

猪嵴病毒福建株结构蛋白VP 基因的克隆与生物信息学分析

为丰富猪嵴病毒结构的分子流行病学数据,明确福建株猪嵴病毒结构蛋白VP的特征,研究运用RT-PCR方法设计特异性引物,对猪嵴病毒结构蛋白进行分段扩增后进行克隆测序,并将测序结果进行拼接后进行生物信息学分析。结果表明,所扩增福建株猪嵴病毒含有完整的结构蛋白VP,其基因全长为2529 bp,编码有843个氨基酸,理论等电点为5.34,理论分子质量为89.603 kD,不稳定系数为37.71,最大疏水指数为2.522,最小疏水指数为-2.622。其和XX株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最高,仅为86.7%,与swine/S-1-HUN/2007/Hungary株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最低,为83.7%。从遗传进化上看,猪嵴病毒结构蛋白在遗传进化上呈现2个独立的分支,中国猪嵴病毒分离株在2个遗传分支上均有分布。     

犬细小病毒VP2基因序列分析

2006~2007年间,从中国农业大学动物医院采集的犬细小病毒粪便样本中随机抽取20份,采用PCR技术,扩增了这20份样本的犬细小病毒VP2全基因序列。经核苷酸及推导的氨基酸序列分析发现,20个样本中,有19个样本属于CPV-2a,1个为CPV-2b,且所有病毒样本的297位均发生Ser→Ala的置换;基因型为CPV-2a病毒样本的555位均发生回归性置换(Ile→Val)。与经典的CPV-2a/b毒株比较,部分样本还出现了新位点氨基酸置换现象。其中,样本CPV/BJ005/07与CPV/BJ008/07 VP2的139位氨基酸残基由Val置换为Ile;80%（16/20）的样本在324位有Tyr→Ile的置换;样本CPV/BJ004/07和CPV/BJ050/07分别在226（Ser→Asn）与382(Arg→Lys)位发生置换。运用DNAStar软件对上述置换的氨基酸残基进行综合分析发现,除Ile-139突变意义不大外,Ile-324、Asn-226和Lys-382均处在VP2蛋白潜在的抗原表位区域,有着重要的生物学意义。     

兔出血症病毒VP60基因的表达及其免疫原性研究

为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E. coli RosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明：经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0 KD处可见明显的表达带,经Western blot鉴定,在62.0 KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。