猪源致病性沙门氏菌四环素耐药基因tetC的PCR扩增及序列分析

四环素类抗生素作为一类广谱抗生素,现已产生严重的耐药性.作为人兽共患病原菌的沙门氏菌,也存在大量这样的耐药菌株,使得本病的发病率和死亡率都不断上升.本研究对规模化猪场分离的经动物试验和生化试验鉴定的致病性沙门氏菌16株、药敏质控菌ATCC25922和沙门氏菌标准株C79-13对进行了四环素、金霉素、土霉素的药敏试验,结果表明16株致病性沙门氏菌对四环素类抗生素表现出普遍耐受性,耐药率达100%.其中MIC值＞128μg/mL的高耐药菌株13株,高耐药率81.25%;MIC值为32μg/mL的低耐药菌株3株,低耐药率18.75%.设计沙门氏菌四环素抗性基因tetC的引物,对16株致病性沙门氏菌的tetC基因做PCR扩增,结果12株菌获得以质粒为模板长约400bp的特异性扩增产物,未能从染色体扩增到产物.分别对临床分离的1株低耐药菌株(DY1)和1株高耐药菌株(SL1-3)的tetC基因扩增产物进行序列分析,结果表明菌株DY1和SL1-3的tetC的核苷酸同源率为97.7%;菌株DY1与质粒PBR322中tetC的核苷酸同源率为98.7%;菌株SL1-3与质粒pBR322中tetC的核苷酸同源率为98.4%,说明对于耐药程度和地方来源各不相同的菌株,在核苷酸序列上同源率很高.本文用PCR技术对规模化猪场分离的致病性沙门氏菌的四环素耐药基因进行了研究,以期对四环素耐药性的分子流行病学进行监测,克服了药敏试验只能检测耐药表型的缺点,为有效控制沙门氏菌感染提供理论基础和科学依据,在兽医、食品卫生和公共卫生等方面具有重要的意义.     

四环素耐药基因在鸡源沙门氏菌中的分布和传播

试验分析了84株鸡源沙门氏菌分离株的四环素耐药性,用PCR方法检测四环素耐药基因在分离株中的分布情况。结果显示,四环素耐药率为49%(41/84),鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌仅携带tet(A)基因(23/23),肠炎沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌携带tet(A)(8/18)、tet(B)(17/18)或tet(G)(10/18)三种基因,tetC基因在这些沙门氏菌中都没有检测到。该类基因多数位于结合性质粒上,但是不在整合子范围内。     

昆明地区鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解昆明周边养鸡场的沙门氏菌耐药状况,采集昆明周边5家养殖场的50只疑似沙门氏菌病的发病鸡的肝脏和脾脏进行细菌分离,通过常规生化特性鉴定和PCR分子鉴定,然后通过药敏试验检测分离株耐药性,通过PCR技术对分离株的耐药基因进行检测。结果表明:共分离出8株沙门氏菌,8株菌的靛基质试验、尿素酶试验和VP试验结果均呈阴性,S3、S4菌株不产H2S,柠檬酸试验也呈阴性,针对沙门氏菌设计特异性引物进行扩增,得到目的条带495 bp,与预期一致;在药敏试验中,分离株对氨苄西林和头孢氨苄有较强的耐药性,对四环素中介耐药,对恩诺沙星、加替沙星、卡那霉素、庆大霉素以及氧氟沙星敏感,说明分离株已出现耐药性;在所检测的6种耐药基因中,β-内酰胺类的bla TEM-1和喹诺酮类的GyrA基因检出率为100%,四环素类的tetA基因未被检出,其他三种耐药基因aadA1、tetB和strB检出率均在50%以上,说明分离株耐药基因的携带率较高,需要引起养殖业的重视。     

猪源致病性沙门氏菌耐药基因的分析

采用平板稀释法，选用氨基糖苷类、四环素类、磺胺类和氯霉素类4大类抗生素的11种药物，对30株猪源致病性沙门氏菌进行了药敏试验，结果有28株菌（93．3％）至少对一种药物有耐药性；对四环素、强力霉素、磺胺甲基异口恶唑、复方新诺明、链霉素、卡那霉索和氯霉素有耐药性的菌株较普遍，在所有菌株中占比例分别为83．3％、80％、80％、76．7％、60％、56．7％和56．7％。设计了25对引物，对耐药基因进行了扩增及序列测定，结果扩增到13种耐药基因，与GenBank中的相应基因有很高的同源性（≥98．1％）。30株猪源致病性沙门氏菌中至少含有一种耐药基因的菌株有28株（93．3％），sul1、aph（3′）-Ⅱa、tetC、Catl、tetA和aadAl耐药基因较为普遍，检出率分别为76．7％、60％、60％、43．3％、40％和36．7％。药敏试验结果与耐药基因检测结果有很高的一致性（≥88％）。     

二重PCR检测猪、鸡源致病性大肠杆菌、沙门氏菌磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2、Sul3)的研究

利用二重PCR对临床分离的猪、鸡源致病性大肠杆菌103株和沙门氏菌33株的3个磺胺类药主要耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行了检测。结果表明,在19株耐SD的沙门氏菌中有17株检测出Sul1或Sul2基因,检出率为89.47%,与药敏试验的结果相比,符合率为89.47%;在56株耐SD的大肠杆菌中有53株检出耐药基因,与药敏试验的符合率为94.64%。二重PCR方法与常规PCR的结果符合率为98.5%,具有很高的一致性;与药敏试验也有很好的符合率,具有较高的特异性。整个试验过程只需7 h,比常规PCR节约7 h,检测速度有了较大的提高。     

全基因组测序技术在猪源沙门氏菌血清分型和耐药性分析中的应用

【目的】为研究全基因组测序技术在猪源沙门氏菌血清型和耐药性检测方面的应用能力。【方法】以60株猪源沙门氏菌为研究对象,应用传统玻片凝集法和微量肉汤稀释法对其进行血清分型和耐药性检测,并提取所有菌株核酸进行全基因组测序组装,利用SeqSero2和ResFinder4在线预测每株菌的血清型和耐药基因,然后与传统方法进行比较分析。【结果】血清凝集试验共鉴定出8种沙门氏菌血清型,而全基因组测序鉴定出9种血清型,二者分型结果的符合率为90.0%;对11种抗菌药物的药敏试验显示：沙门氏菌对四环素（73.3%）的耐药率最高,其次为氨苄西林（66.7%）、磺胺异噁唑（66.7%）和复方新诺明（53.3%）,基于全基因组预测的恩诺沙星、美罗培南、头孢噻呋和阿奇霉素的耐药性与药敏试验结果完全一致,对氨苄西林、磺胺异噁唑、四环素预测的结果符合率也均大于90.0%。【结论】全基因组测序分析的沙门氏菌血清型和耐药性与常规检测方法的符合率较高,且具有操作简便的优势,可以作为分析沙门氏菌血清型和耐药性的有效方法。     

屠宰场沙门氏菌耐药性分析和毒力基因检测

【目的】研究广东省茂名地区屠宰环节猪肉中携带的沙门氏菌的耐药性和毒力特征,为该地区食源性沙门氏菌的危害评估和防控措施制定提供依据。【方法】从广东省茂名地区屠宰场采集的猪肉、脾脏、肝脏样本中分离到19株沙门氏菌,采用K-B药敏纸片法检测其对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类和磺胺类抗菌药物的耐药性,用PCR方法检测β-内酰胺类耐药基因(bla_TEM、bla_OXA-1、bla_SHV)、氟喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrS、qnrB)、氨基糖苷类耐药基因(aadA1、aac(6′)-Ⅰb、rmtB)、四环素类耐药基因(tetA、tetB、tetC)、酰胺醇类耐药基因(Cat1、floR)、磺胺类耐药基因(SulⅠ、SulⅡ、SulⅢ)和10种毒力基因(mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、spvR、spvA、spvB、spvC、spvD)的携带情况。【结果】19株沙门氏菌耐药严重,对四环素、多西环素、氯霉素、氟苯尼考、磺胺异噁唑的耐药率均>50%,对四环素、多西环素和氯霉素的耐药率最高...     

鸡源性沙门氏菌耐药基因检测与耐药相关性分析

为研究沙门氏菌耐药基因与其耐药性之间的关系,本研究以K-B纸片法对临床分离的29株鸡源性沙门氏菌进行10种抗菌药物敏感性测定,应用PCR技术进行这些抗菌药物相关耐药基因检测.并通过质粒接合试验证明了耐药性及耐药基因的转移.结果显示:29株分离株对氨苄西林耐药率为31.0％,对头孢唑啉耐药率为10.3％,对四环素耐药率为44.8％,对复合磺胺耐药率为41.4％,对氯霉素耐药率为3.4％,对环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的耐药率均为37.9％,但对庆大霉素和卡那霉素均敏感.本实验共检测到8种耐药基因,其中blatem-1阳性率为31.0％,tetA和tetB阳性率为44.8％,sull和sul2阳性率为41.3％,aadAl阳性率为3.4％,dfrA1阳性率为10.3％,qnr阳性率为37.9％,而tetG、blaCMY-2和catI均未检出.此外,通过与非耐药菌接合后绝大部分接合子均获得了供体菌质粒编码的相应抗性表型,耐药基因在接合过程也发生了转移,赋予被接合细菌新的耐药性.以上结果表明沙门氏菌的耐药性与其相关耐药基因的检出率基本一致,而且耐药性通过质粒进行转移.     

鸡源性多重耐药沙门氏菌 类整合子与耐药基因研究

本试验旨在了解鸡源性沙门氏菌分离株多重耐药与Ⅰ类整合子及耐药基因的携带关系。采用K-B纸片法对29株鸡源性沙门氏菌分离菌株进行10种抗菌药物敏感试验;应用PCR技术对分离菌株进行Ⅰ类整合子及耐药基因检测。29株分离株中有13株对2种以上抗菌药物耐药,属于多重耐药株,氨苄西林-四环素-头孢唑啉-复合磺胺是主要多重耐药谱;13株多重耐药菌中有8株携带Ⅰ类整合子,blatem-1、tetA和tetB基因检出最高。结果表明沙门氏菌多重耐药性与整合子的携带之间关系密切,耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致。     

细菌全基因组测序技术用于沙门氏菌流行病学调查的可行性分析

为探讨细菌全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术在基层沙门氏菌防控中的优势与可行性，对前期分离的9株沙门氏菌进行细菌全基因组测序，并进行血清型预测、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和耐药基因分析，将全基因组测序结果与传统血清分型和耐药性分析结果进行对比。结果显示：基于全基因组测序数据的血清分型结果与传统血清分型结果符合率为100%，两种方法对9株沙门氏菌血清分型结果完全一致；两种方法分析出的β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类和氨基糖苷类药物的耐药基因与耐药表型符合率为100%，即耐药菌株中均含有4大类抗菌药物的耐药基因；用全基因组测序检测到利福平、磺胺类和四环素3大类抗菌药物的7个耐药基因，表明9株沙门氏菌可能对这3大类抗菌药物耐药。结果表明：全基因组测序结果与传统实验室诊断结果完全一致，且具有快速、低成本、操作简单等优势，并且随着测序技术的发展，其检测成本和周期将进一步缩减，因此基于细菌全基因组测序开发沙门氏菌快速分型和耐药性分析方法有一定的应用价值和可行性。     

猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法.结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测下限为10个拷贝/μL;批内变异系数和批间变异系数分别为0.43％～0.64...     

鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性分析

为探究温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素的耐药性,试验采用PCR法检测10株来源不同的鱼源温和气单胞菌对氨基糖苷类抗生素的4种耐药基因（aph（3'）-Ⅱa、ant（3″）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb、aac（3）-Ⅱa）及四环素类抗生素的3种耐药基因（tetA、tetC、tetM）的表达情况,并利用K-B纸片扩散法对6种抗生素进行耐药表型分析。结果显示,10株温和气单胞菌对氨基糖苷类耐药基因aph（3'）-Ⅱa、ant（3″）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb的检出率分别为20%、30%、20%,未检测出aac（3）-Ⅱa基因;对四环素类的耐药基因tetA、tetC、tetM的检出率分别为70%、20%、60%。K-B纸片扩散法结果显示,10株菌对四环素耐药率最高,对链霉素敏感,对庆大霉素、卡那霉素、多西环素、米诺环素高度敏感。结果表明,本次分离的温和气单胞菌对氨基糖苷类和四环素类抗生素具有一定的耐药性,为深入了解温和气单胞菌的耐药机制提供参考。     

地高辛标记大肠杆菌1型菌毛结构基因核酸探针对鸡大肠杆菌分离株的检测

将PCR扩增的鸡大肠杆菌 1型菌毛蛋白结构基因 (pilA)用地高辛标记成核酸探针与分属 2 8个血清型的 50个鸡大肠杆菌分离株进行斑点杂交 ,阳性率达 84% ,用甘露糖敏感血凝试验 (MSHA)检测阳性率为 72 % ,表明核酸杂交比MSHA法更敏感。     

胸膜肺炎放线杆菌对四环素类抗生素的耐药分析及相关基因检测

四环素类药物是在兽医临床中常用的一类抗生素,为了解胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)对四环素类抗生素的耐药情况,本研究对从临床分离鉴定的85株APP进行了四环素类抗生素临床耐药情况和相关基因的分析和检测。应用药敏纸片法进行药敏试验,结果:APP对四环素的耐药率较高为76.5%,其次为金霉素54.1%、美他环素48.2%、多西环素45.9%、土霉素28.2%、米诺霉素25.9%、替加环素22.3%。采用PCR方法对四环素类10种耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL1和tetL2进行检测,结果:tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL2、tetL1耐药基因的扩增阳性率分别为78.8%、41.2%、15.3%、8.2%、21.2%、15.3%、43.5%、24.7%和30.6%,而tetL1扩增则全部阴性,未检出其耐药基因。本研究结果为四环素类抗生素在猪传染性胸膜肺炎临床上的应用和新药研发提供了一定的理论依据。     

广东地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3感染情况的调查

对广东省不同地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3的流行病学情况进行调查。采集的病料样品,通过常规PCR进行PCV3检测与全基因扩增,分析其全基因的遗传进化关系。将获得的16株PCV3毒株核酸序列与其他环状病毒参考毒株对全基因组和Cap基因进行遗传变异分析,结果显示,新生仔猪的先天性震颤猪群中PCV3样本总阳性率高达58.2%。16株PCV3毒株之间全基因核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与美洲代表毒株PCV3-US/MO2015全基因核苷酸序列同源性在98.8%~99.1%之间;16株PCV3毒株之间Cap基因的核苷酸序列同源性为99.7%~100%,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为99.1%~100%。遗传进化分析显示,16株PCV3毒株都属于PCV3a分支。PCV3在我国广东省新生仔猪先天性震颤猪群中广泛存在。     

北京市猪场猪圆环病毒3型感染状况调查及其ORF2基因遗传进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在北京市不同区县猪场中的流行情况,研究建立PCR检测方法,对来自北京市8个区县56个养殖场的1177份临床样品进行检测,并对获得的部分ORF2全基因序列进行遗传进化分析。结果显示,PCV3总体阳性率为1.0%(12/1177),猪场阳性率为8.9%(5/56)。对PCV3阳性样本进行ORF2基因测序及同源性比对,共测得12株PCV3 ORF2全长基因序列,其中包括6株不同的ORF2全长基因序列。结果显示,该6株序列之间的核苷酸相似性为97.7%～99.5%,推导氨基酸序列的相似性为97.2%～100%;与参考毒株之间的核苷酸同源性为96.0%～99.5%,推导氨基酸同源性为92.1%～100.0%;进化树显示北京毒株属于PCV3b基因型。试验表明,PCV3在北京多个猪场呈现一定的流行趋势,流行毒株以PCV3b基因型为主。     

鸡大肠杆菌traT基因的扩增及TraT-DIG探针制备

以致病性Ｅ．ｃｏｌｉ的质粒为模板,用人工合成引物扩增出致病性相关的ｔｒａＴ基因核心部分;将菌株的致病性与ｔｒａＴ基因的扩增结果进行比较,强致病力菌株均扩增出ｔｒａＴ基因,无致病力菌株未扩增出ｔｒａＴ基因,约大多数中等致病力菌株亦扩增出ｔｒａＴ基因。扩增获得的ｔｒａＴ基因经纯化后标记地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｎ,ＤＩＧ）研制出ｔｒａＴ－ＤＩＧ基因探针,该探针与鸡沙门氏菌、鸡白沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌不发生     

云南省思茅地区乙型脑炎病毒及黄热病毒的分子流行病学监测

2009年至2010年,在云南省思茅地区普文镇、思茅区、震东乡、六顺乡、勐旺乡等地共采集17880只蚊子(分为91管),其中库蚊16500只(83管),按蚊1380只(8管)。采用RT-PCR方法,对91管蚊虫样本进行流行性乙型脑炎病毒NS1基因及黄热病毒E基因片段扩增,回收阳性PCR产物,并进行测序和遗传进化分析。结果表明,思茅地区库蚊乙型脑炎病毒检测阳性率为18.1%(15管/83管),黄热病毒检测阳性率为15.7%(13管/83管),思茅地区按蚊乙型脑炎病毒检测阳性率为25%(2管/8管),黄热病毒检测阳性率为12.5%(1管/8管)。克隆的流行性乙型脑炎病毒NS1基因及黄热病毒E基因与JEV和YFV参考株进行序列比对,与乙型脑炎病毒参考株同源性为88.3%～90.7%。监测结果显示,思茅地区蚊子JEV和YFV带毒率均较高,表明当地两种虫媒病毒病流行风险高。     

伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病毒gD基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病毒的PeR引物和一条Taqman荧光探针,采用LightCycle 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1．0×10^1-1．0×10^10拷贝,灵敏度可达2拷贝,比常规PCR高100倍。该方法检测时间短,速度快,仪器的运行时间仅为1h,特异性明显高于常规PCR。对15株猪伪狂犬病毒进行了检测,结果均为阳性;与猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养和常规PeR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好的优点,可望用于,临床上伪狂犬病的检测和病毒分布的研究等。