家兔孵化囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究

采用两种方法对家兔孵化囊胚作玻璃化冷冻保存在25℃室温下，将孵化囊胚直接移入EFS40溶液中短时间平衡后，直接投入液氮中冷冻保存(简称一步法)；或将胚胎在10％或20％EG溶液中经预处理后，再移入EFS40溶液冷冻保存(简称二步法)。结果表明，一步法冷冻后的胚胎发育率为68％，与对照组(鲜胚)的差异极显著(P<0.01)；二步法冷冻后的胚胎发育率高达93％，与对照组的差异不显著(P>0.     

家兔扩张囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究

本试验对家兔扩张囊胚的玻璃化冷冻保存技术进行了探讨。首先在２０℃室温下，将扩张囊胚直接移入ＥＦＳ４０溶液中短时间平衡后，直接投入液氮中冷冻保存（一步法）；或胚胎在１０％～２０％ＥＧ（或ＥＦＳ２０）溶液中经预先处理后，再移入ＥＦＳ４０中冷冻保存（二步法），解冻后的胚胎发育率达到９５％～１００％。当室温提高到２５℃时，一步法和二步法冷冻的胚胎均得到了较高的发育率（８９％～９０％）。利用２０℃条件下一步法即２分钟平衡后冷冻的胚胎移植后，妊娠受体的产仔率为２９．２％（７／２４），同对照组产仔率３２．４％（１１／３４）相比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻.结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P＜0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P＞0.05);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P＜0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响.     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻。结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P<0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P>0.0 5);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P<0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响。     

扩张囊胚玻璃化超低温冷冻保存及移植技术的研究

本试验探讨了对鼠扩张囊胚玻璃化冷冻保存后，提高发育率的最佳条件。玻璃化溶液是用ＰＢＳ液稀释成的３０％聚蔗糖＋０．５Ｍ蔗糖混合法，再将乙二醇（ＥＧ）调制成２０、３０及４０％（ｖ／ｖ）的溶液，即ＥＦＳ２０、３０及４０。玻璃化冷冻保存是１０、２０及２５℃温度下，将扩张囊胚直接移入ＥＰＳ溶液后投入液氮中一步法令冻保存，其中２５℃下保存后的发育率最高（８７％）。继之将扩张囊胚用１０％ＥＧ溶液经５分钟处理后，再移入ＥＦＳ４０中二步法冷冻保存，发育率高达９４％。利用二步法冷冻保存的扩张囊胚移植后，妊娠受体的产仔率为６６％（１６８／２５５），同时照组产仔率６１％（８０／１３２）相比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。     

细胞松驰素B（CB）对水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响

研究主要探讨冷冻前细胞松弛素B（CB）预处理水牛MⅡ期卵母细胞对其冷冻效果的影响。以水牛MⅡ期的卵母细胞为材料，通过玻璃毛细管（GMP）和玻璃化冷冻液EDS33（16．5％EG＋16．5％DMSO＋Sucrose）对水牛MⅡ期的卵母细胞进行两步法玻璃化冷冻保存，即卵母细胞首先放入预平衡液（7．5％EG＋7．5％DMSO＋Sucrose）中平衡3min，然后再移入玻璃化冷冻液中30s后装管直接投入液氮。冷冻前卵母细胞随机分为2组，一组用7．5μg／mLCB预处理30min，另一组未用CB预处理作对照组。然后都冷冻保存。解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的。解冻后存活的卵母细胞进行孤雌激活，以分裂率和囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标。结果发现，GMP组和GMP＋CB组卵母细胞解冻后的存活率（88．89％、94．20％）和培养后发育到囊胚的比率（8．82％、14．55％）差异均不显著（P〉0．05），但GMP组和GMP＋CB组存活卵母细胞激活后的分裂率差异显著（32．69％、55．56％，P〈0．05），所以细胞松弛素B预处理可以提高GMP冷冻卵母细胞的发育能力。．     

鸡囊胚细胞冷冻损伤的评价方法

采用滤纸环法分离鸡囊胚细胞(blastodermal cells,BCs),冷冻复苏后使用二乙酰荧光素(fluorescein diacetate,FDA)测定细胞活率,以及培养24h测定细胞贴壁率简称贴壁率法,探究2种方法在不同冷冻程序优化试验中对细胞冷冻损伤的评价效果。结果显示,FDA染色法与贴壁率法在冷冻保护剂浓度优化、冷冻及解冻速率优化试验中对细胞冷冻损伤的评价结果差异不显著(P0.05),相关性很好,但也有一定差异;不同冷冻剂浓度优化试验中,5%DMSO冷冻保护液有细胞活率,但无贴壁现象;投入液氮温度对比试验中,-35℃以后,随着投入温度的降低,细胞活率略微升高,但贴壁率呈较明显的下降趋势。因此,2种方法均适合鸡BCs冷冻损伤评价,但贴壁率法能给出更多关于细胞状况的信息,评价结果更加真实可靠。     

牛体外受精扩张囊胚的玻璃化超低温冷冻保存及移植技术的研究

本试验对牛的扩张囊胚的冷冻保存技术进行了探讨。在２５℃温度下，利用ＥＦＳ４０的玻璃化溶液，将扩张囊胚直接移入此液中平衡后，投入液氨中一步法冷冻保存。或胚胎移入ＥＦＳ４０之前，在１０％ＥＧ溶液中预先处理，二步法冷冻保存。其解冻后获得了较高的发育率（分别为５９％ＶＳ６３％）。冷冻保存的胚胎移植后的妊娠率及产仔率分别高于对照组（８０％ＶＳ５５％；５５％ＶＳ２３％）。     

纽胞松弛素B(CB)对水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的影响

研究主要探讨冷冻前细胞松弛素B(CB)预处理水牛M Ⅱ期卵母细胞对其冷冻效果的影响.以水牛M Ⅱ期的卵母细胞为材料,通过玻璃毛细管(GMP)和玻璃化冷冻液EDS33(16.5%EG 16.5%DMSO Sucrose)对水牛M Ⅱ期的卵母细胞进行两步法玻璃化冷冻保存,即卵母细胞首先放入预平衡液(7.5%EG 7.5%DMSO Sucrose)中平衡3 min,然后再移入玻璃化冷冻液中30 s后装管直接投入液氮.冷冻前卵母细胞随机分为2组,一组用7.5μg/mL CB预处理30 min,另一组未用CB预处理作对照组,然后都冷冻保存.解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的.解冻后存活的卵母细胞进行孤雌激活,以分裂率和囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标.结果发现,GMP组和GMP CB组卵母细胞解冻后的存活率(88.89%、94.20%)和培养后发育到囊胚的比率(8.82%、14.55%)差异均不显著(P＞0.05),但GMP组和GMP CB组存活卵母细胞激活后的分裂率差异显著(32.69%、55.56%,P＜0.05),所以细胞松弛素B预处理可以提高GMP冷冻卵母细胞的发育能力.     

绵羊卵母细胞的玻璃化冷冻保存

玻璃化法是近几年才建立起来的一种细胞、胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术。Nekagata和Shaw分别于1989年和1991年用此化法冷冻保存小鼠成熟卵母细胞,取得理想结果。本实验对玻璃化法冷冻保存绵羊卵巢内卵母细胞作了尝试。1 材料与方法从屠宰后东北细毛羊取出卵巢,用注射器从直径2～6mm的卵泡中抽取卵丘—卵母细胞复合体,选择正常的用成熟培养液(M199+10%FCS)洗2次后,转入VS_1(20.5%(w/v)二甲基亚砜,     

绵羊体内外受精胚胎玻璃化冷冻保存

用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5)     

卵巢玻璃化冷冻保存研究进展

卵巢玻璃化冷冻是一种操作简单、冷冻效果好的卵巢组织冷冻降温技术,对动物繁殖能力保存、物种保护、生物多样性保存,以及动物胚胎工程和人类临床医学研究与应用等具有重要意义。卵巢组织冷冻保存较卵母细胞冷冻保存,具有明显的优点。在冷冻保护剂的选择、冷冻材料、冷冻平衡及冷冻方法上都有其特殊之处。卵巢组织冷冻保存技术已在人类医学临床上发挥其应用价值。     

牛胚胎玻璃化冷冻保存研究初报

传统的胚胎冷冻方法需诱发结晶,按一定速率降温,不仅程序复杂费时间（需几小时）,而且还得使用价值昂贵的胚胎冷冻仪。为此,１９８５年Ｒａｌｌ等人首先发明了玻璃化冷冻法［１］,不使用冷冻仪,将冷冻时间缩短（约为３０ｍｉｎ）。但他们选用的是以大约７ｍｏｌ／Ｌ二甲基亚砜为主的抗冻剂,因其化学毒性大,对胚胎的存活带来一定影响［２,３］。１９８６年Ｓｃｈｅｆｆｅｎ等人,利用丙三醇及丙二醇为抗冻保护剂,因化学毒性仍较大,冷冻保存后的胚胎成活率仍不稳定［４］。针对化学毒性问题,１９９０年Ｋａｓａｉ等人利用化学毒性…     

猪卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

卵母细胞冷冻保存对于畜牧业生产和人类辅助生殖具有重要意义。随着玻璃化冷冻技术日趋成熟,其现已广泛应用于牛、羊等大家畜的卵母细胞冷冻保存。然而,猪卵母细胞的冷冻保存至今仍处于试验研究阶段,由于猪卵母细胞脂质含量高,对低温敏感,在玻璃化冷冻保存过程中极易受到冷冻保护剂毒性以及渗透胁迫、氧化应激等损伤,造成细胞骨架以及亚细胞器受损,最终导致细胞发育能力降低甚至死亡。近年来,人们在提高猪卵母细胞冷冻保存效率的研究中取得了突破性进展。本文简要介绍了卵母细胞冷冻保存的常见方法及作用机理,总结了猪卵母细胞在玻璃化冷冻过程中造成的细胞损伤类型及影响,概述了人们针对不同类型的冷冻损伤提出的解决方法和取得的成就,并对其应用前景进行展望,为今后提高猪卵母细胞的玻璃化冷冻效率提供新思路。     

鸡胚原始生殖细胞(PGCs)玻璃化冷冻的研究

对发育至第19期和第28期鸡胚性腺原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），用6种玻璃化冷冻液1：10％DMS0＋10％EG＋10％PVP，Ⅱ：20％EG＋10％PVP，Ⅲ：20％DMSO＋10％PVP，Ⅳ：10％DMSO＋10％EG＋0．5mol／L Surcose，Ⅴ：20％EG＋0．5mol／LSurcose，Ⅵ：20％DMSO＋0．5mol／L Surcose进行冷冻保存。结果：第19期鸡胚PGCs玻璃化冷冻复苏后存活率，在冷冻液Ⅱ与Ⅳ之间差异不显著（P〉0．05），Ⅴ与Ⅵ之间差异显著（P〈0．05），其余各冷冻液之间差异均极显著（P〈0．01）。第28期鸡胚PGCs玻璃化冷冻复苏后存活率，在冷冻液Ⅳ与Ⅴ之间差异显著（P〈0．05），Ⅲ与Ⅳ、Ⅴ之间差异不显著（P〉0．05），Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ之间差异不显著（P〉0．05），其余各玻璃化冷冻液之间差异均极显著（P〈0．01）。复苏后接种培养传至第2代的鸡胚PGCs细胞，PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。     

哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

综述了近年来关于哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展,并对这项技术的发展前景进行展望。重点讨论了影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的几种因素,包括冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻方法和卵母细胞所处的发育阶段等,以及冷冻过程中细胞膜、微丝、微管、皮质颗粒、纺锤体和线粒体等出现的损伤。目前,玻璃化冷冻法存在的最主要问题是冷冻过程中造成超微结构不可逆转的损伤影响胚胎发育,亟待解决。     

哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

综述了近年来关于哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展,并对这项技术的发展前景进行展望.重点讨论了影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的几种因素,包括冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻方法和卵母细胞所处的发育阶段等,以及冷冻过程中细胞膜、微丝、微管、皮质颗粒、纺锤体和线粒体等出现的损伤.目前,玻璃化冷冻法存在的最主要问题是冷冻过程中造成超微结构不可逆转的损伤影响胚胎发育,亟待解决.     

转移早期囊胚期细胞制备的嵌合体鸡

用显微注射方法将尼拉商品鸡鸡胚X期细胞液注入同期海兰鸡的囊胚腔中，再经体外培养至出雏，获得尼拉--海兰嵌合体鸡，嵌合体率为5%（3/60），出雏率为15%（9/60）。另一项实验是将受体鸡胚经过600rad^60Co辐射处理后再注入供体细胞并体外培养至出雏，结果嵌合体率为14.0%(8/57），孵化率为15.8%(9/57），其中两只毛色嵌合体公鸡存活至今已经8个月。嵌合体鸡的黑色羽毛可出现在多个部位，有两只鸡的腿部和喙的角质也出现黑色斑。嵌合体鸡血液DNA具有供体鸡的特征带。本研究为进一步制备转基因鸡奠定了基础，也为鸡的发育生物学研究和遗传学研究提供了实验材料。     

哺乳动物胚胎玻璃化冷冻保存的研究进展

自1985年胚胎玻璃化冷冻(v itrification)保存技术发明以来,玻璃化法先后在小鼠、兔、绵羊、牛、猪、山羊等动物胚胎上获得成功,近年来有关哺乳动物胚胎玻璃化冷冻保存的研究主要集中在冷冻和解冻方法上,相继发明了一些新的玻璃化冷冻方法:冷环玻璃化法(cryo loop)和开放式细管法(open pu lled straw,OPS),并且对解冻后细管内直接脱除防冻剂进行了广泛深入的研究,使得冷冻胚胎移植更易于在生产上推广应用。现将胚胎玻璃化冷冻的原理、冷冻保护剂、冷冻方法、解冻后保护剂脱除方法的最新研究进展作一综述。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻保存技术的研究进展

卵母细胞冷冻保存技术在动物种质资源保存、濒危动物保护等方面具有独特的作用,猪卵母细胞的冷冻保存仍是一项世界性难题,尚处于摸索阶段。现就猪卵母细胞冷冻保存的现状、冷冻原理与方法及冷冻损伤等问题进行综述。