母源抗体对腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2免疫效力的影响

本实验室前期构建了具有标记特征的腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2,效力评价结果表明该嵌合疫苗的免疫原性与C株相当,并且能够完全提供对猪瘟病毒(CSFV)强毒石门株的攻毒保护。为进一步确定该疫苗的免疫效力是否受其母源抗体(MDA)的干扰及制定合理有效的免疫程序,本研究将rAdV-SFV-E2疫苗株免疫妊娠期的母猪后检测其抗体诱导水平,然后将该疫苗株免疫具有其母源抗体的30日龄新生仔猪及无母源抗体仔猪(n=4),攻毒后,监测所有仔猪的抗体水平、临床症状、病毒血症、病理学等。结果显示,有无母源抗体的仔猪均能够产生高水平的特异性E2抗体及抗CSFV的中和抗体,而且攻毒后未出现猪瘟特异性临床症状,包括发热、食欲减退、腹泻及死亡等;对照组仔猪均出现了明显的临床症状,其死亡率为100%。本研究证明rAdV-SFV-E2疫苗的免疫效力未受其母源抗体的显著干扰,免疫30日龄的仔猪后能够完全抵抗致死性CSFV强毒石门株的攻击。     

非洲猪瘟病毒载体疫苗研究进展

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种烈性传染病,严重影响畜牧业发展,可造成巨大经济损失,目前对其仍缺乏有效的治疗手段,其疫苗也处于研究阶段。病毒载体疫苗作为一种经济省时的新型疫苗,免疫效果稳定且安全,可用于递送ASFV免疫原,对于发展ASF免疫防控技术研究有着重要意义。本文对ASFV病毒载体疫苗研究进展进行综述,重点介绍ASFV现有病毒载体疫苗免疫原选择和各病毒载体抗原递呈效果及其免疫原性,为后续ASFV的免疫学研究和病毒载体疫苗研发提供参考。     

酵母表达典型猪瘟E2亚单位疫苗对致死量攻毒提供保护

典型猪瘟（CSF）由典型猪瘟病毒（CSFV）引起,是一个高度传染的猪病,给猪业生产造成巨大的经济损失。病毒衣壳糖蛋白E（ms）和E2是感染该病毒后诱导产生CSFV抗体的主要靶向目标。毕赤酵母表达E2蛋白（yE2）可产生免疫保护．对抗CSFV攻毒。     

猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫攻毒保护效力试验

为了评价猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫效果,本试验在试验猪场用猪瘟E2亚单位疫苗与猪瘟减毒活疫苗分别免疫供试猪,并定期测定猪瘟病毒抗体。饲养至24周龄时,每组随机选取5头运至检验动物房,用猪瘟石门系强毒进行人工感染。根据试验猪攻毒后临床症状、病理剖检和猪瘟抗原、抗体检测结果,比较分析了猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫保护力。结果显示,对照组的试验猪攻毒后12 d内全部死亡,并表现出典型的猪瘟症状和病理变化;免疫猪全部存活,未见猪瘟症状和肉眼可见的组织器官病变,血样的猪瘟抗原ELISA检测结果均为阴性。结果表明,猪瘟E2亚单位疫苗单剂量免疫1次后,24周仍能为靶动物提供可靠的免疫保护效力,与猪瘟减毒活疫苗2次免疫的保护效力相当。     

猪瘟病毒E2基因活载体疫苗研究进展

猪瘟病毒(CSFV)E2囊膜蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原蛋白,也是研究猪瘟基因工程疫苗的首选抗原。常用的猪瘟病毒E2基因活载体主要有腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、伪狂犬病病毒载体、杆状病毒载体等,且每种病毒载体各有其优势特点。国际上应用病毒载体已成功研制出猪瘟新型疫苗并应用于临床。论文主要介绍了目前常用的病毒载体,并分别列举了使用这些表达载体进行猪瘟基因工程疫苗研究的进展情况。     

ASF病毒载体疫苗的研究与展望

非洲猪瘟(ASF)是猪的一种病毒性疾病,死亡率高达100%。ASF造成的广泛而巨大的经济损失对非洲、亚洲等多数国家的养殖业产生了不利影响。目前,针对ASF的疫苗开发是一个亟待解决的问题。本文就各种病毒载体作为靶向ASF病毒基因载体的检测结果进行了综述,以期为ASF疫苗的研制和开发提供技术支持。     

非典型性猪瘟病毒云南株/石门株嵌合病毒的构建和拯救

为研究猪瘟病毒(CSFV)云南株(YN株)突变位点在致非典型性猪瘟中的作用,本研究在CSFV石门株全长感染性克隆的基础上,利用分子克隆技术,将CSFV YN株的1 510位～1 532位、2 471位～2 658位、3 152位～3 176位和11 785位～11 816位突变位点基因序列替换CSFV石门株的相应基因序列,构建出嵌合的CSFV感染性克隆质粒pAC-SM-YN。全基因测序鉴定后,体外转录得到病毒RNA,经脂质体转染PK-15细胞方法拯救出了嵌合病毒vSM-YN。经直接荧光染色、对突变位点RT-PCR以及ELISA检测表明拯救嵌合病毒vSM-YN传代稳定。本研究为研究CSFV结构蛋白、病毒致病机理、新型疫苗,尤其是非典型猪瘟的致病机理奠定了基础。     

猪瘟兔化弱毒疫苗与我国近年猪瘟野毒的免疫保护相关性试验

２批猪瘟兔化毒睾丸细胞苗分别来自两家兽医生物药品厂，各分别免疫接种猪只，随后以５株猪瘟病毒野毒分别攻击，疫苗接种猪完全存活，对照猪完全死亡。此５株野毒分离自国内不同地区，并皆已经过细致的鉴定，以免疫荧光技术对猪扁桃体进行了活体检查，各对照猪材料上能在攻击后一周时出现病毒，而疫苗接种猪在整个观察期间未出现病毒，据此，显然可见猪瘟兔化毒细胞苗在预防国内猪瘟上极有效力     

猪瘟兔化弱毒疫苗的临床试验

1效力用我国生产的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞苗免疫无猪瘟抗体及抗原的易感猪,每头皮下注射1头份,14天后分别攻击猪瘟野毒,每头皮下注射猪瘟血毒2毫升。结果表明,猪瘟弱毒细胞苗对9株野毒均具有坚强的保护力,免疫组100％保护,对照组76．5％死亡。以猪瘟荧光抗体法（HCFA）检查,     

3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响

将 2 0头 9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征抗原、抗体阴性猪分成 6组 ,分别利用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV)单独或混合感染。 7d后连同对照猪 4头 ,免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗 (HCL V) ,13d后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温 ,观察临床症状 ,每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果表明 ,非猪瘟病毒感染 7d后 ,所有各组猪均从体内检测到了相应感染的病原 ,表明 3种非猪瘟病毒感染成功。在攻击猪瘟石门强毒后 2周 ,感染了非猪瘟病毒后接种 HCL V疫苗的 4个免疫组 12头猪除 1头外 ,11头全为猪瘟病毒 (HCV)抗原检测阳性 ,且多呈强阳性 ;而单一 HCL V疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到 HCV;所有 HCL V疫苗免疫猪均存活 ,而非免疫对照组 4头猪全部在攻毒 16 d内死亡。     

猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒2型的检测

为对上海某猪场送检的一份猪瘟疫苗进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测,本研究将猪瘟疫苗样品接种于MDBK细胞,盲传15代后仍无致细胞病变效应,但间接免疫荧光试验表明接种该疫苗后的MDBK细胞能够被单克隆抗体BZ-53(BVDV-2)识别。采用BVDV-1和BVDV-2的5’-UTR的通用检测引物和针对BVDV E2的引物,对样品RNA进行RT-PCR检测,结果显示,样品能够扩增出约288 bp的BVDV特异性片段;此外,5’-UTR和E2基因片段的测序分析结果表明分离株属于BVDV-2,并且其E2基因与牛源XJ-04株(BVDV-2)的E2基因同源性最高(92.3%),而与猪源ZM-95株(BVDV-1)的E2基因同源性较低(64.5%)。由此证明,该猪瘟疫苗中的确污染有一株BVDV-2株。     

猪瘟抗体间接ELISA检测方法的建立和优化

采用真核系统表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被物,通过对各个反应条件的摸索和优化,建立了检测猪瘟病毒抗体的猪瘟抗体间接ELISA检测方法。研究结果表明,E2蛋白的最佳包被浓度为0.25μg/mL,最佳包被条件为4℃16h;待检血清的最佳稀释倍数为100倍;特异性检测试验证明,该方法与猪常见病原的阳性血清没有交叉反应。通过对大量猪瘟抗体阴、阳性血清的检测,最终确定了本检测方法的判定标准。     

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1抗原亚区的表达

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2存在4个不同抗原区(A-D)，根据中和特性和保守性差异，将A抗原区进一步划分为A1、A2、A3抗原亚区，A1抗原亚区在不同猪瘟病毒分离毒株中高度保守且诱导的单克隆抗体具有中和特性。本采用pRSET C载体，对A抗原区2744nt～2947nt(791aa～858aa)基因片段(EC)进行克隆、表达，并分析表达产物的免疫反应性。研究发现：EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410发生特异性结合，且此结合能被猪瘟病毒抗原或阳性血清阻断。结果表明：A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。     

不同年龄猪群中猪瘟抗体监测及免疫效果分析

为制订合理的猪瘟免疫程序,本研究采用正向间接血凝试验(IHA)对某规模化猪场进行猪瘟免疫监测和分析。结果表明:猪瘟母源抗体的合格率、抗体效价平均值均存在随着仔猪日龄的增长而呈逐渐下降的趋势;35 d～40 d仔猪母源抗体的合格率达78.79%、抗体平均效价为5.97 Log2;仔猪35 d～40 d实施猪瘟首免,其一免抗体合格率和抗体效价均比20 d首免有所提高;同一窝仔猪的猪瘟母源抗体,有11%窝次的猪差距在3个～8个滴度;母猪猪瘟免疫抗体的合格率,一胎母猪稍低,其它经产母猪基本接近;猪瘟抗体效价的平均值随胎龄增加而升高,并且抗体的离散度则随胎龄增加而缩小。因此,在母猪实施与仔猪同时免疫的猪场,40日龄左右是较佳的首免日期。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组的遗传变异分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计了9对引物，用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒疫苗株细胞培养物中扩增得到了覆盖猪瘟病毒基因组全长的9个cDNA片段，将所得cDNA片段分别克隆至pMD18-T载体中，经测序和拼接后，获得了猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全长12310个碱基，其5’非编码区（5＇-NCR）和3＇-NCR分别由373和239个碱基组成，在3’末端有富含T的碱基插入，其间为1个大的开放阅读框架，编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白，与国内外已发表的另外7个猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列相比，核苷酸同源性为98．7％～99．9％，氨基酸同源性为98．6％～99．9％。基因组全序列比较显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组在遗传上相当稳定。     

猪瘟病毒的分离鉴定及其E2基因序列分析

2004~2005年上海和江苏3家猪场发生仔猪急性死亡,用ELISA鉴别试剂盒证明为猪瘟感染。用PK15细胞分离病毒,传代至第3代无细胞病变,RT-PCR扩增E2基因为阳性,扩增片段经纯化后克隆入T载体并进行序列测定。通过DNAStar软件对3株病毒的基因序列进行了比较,同时构建了系统进化树,结果表明,三株病毒分离株均扩增出269bp片段并且核苷酸序列100%同源,这3株与Alfort、Shimen株、兔化弱毒株(HCLV)和Brescia4个标准毒株核苷酸序列同源性均在90%以上,说明在江苏、上海地区分离得到的3株猪瘟病毒与流行毒株在基因序列上没有发生大的变异。     

猪瘟病毒囊膜结构(糖)蛋白Erns和E2的生物学特性研究

猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)和长颈鹿瘟病毒(Giraffe pestvirus)为黄病毒科瘟病毒属成员,其病毒结构、抗原性和遗传特性密切相关.CSFV囊膜结构(糖)蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.囊膜结构(糖)蛋白Erns/E0(gp48)具有BNA酶活性,在病毒增殖及中和病毒感染中发挥重要作用,是诱导机体产生保护性免疫应答的第二抗原蛋白.E2和Ens与细胞表面受体的相互作用介导CSFV对细胞的感染过程.本文综述CSFV囊膜结构(糖)蛋白Erns和E2的生物学特性研究进展.