鸡大肠埃希氏菌菌毛表达、血凝谱及粘附特性研究

对６株具有不同致病性的鸡大肠埃希氏菌分离株体外菌毛的表达、对１３种不同红细胞血凝谱及血凝方式、对鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）及在体内外对１日龄鸡气管组织的粘附特性进行了研究,结果表明,具有致病性的菌株,在体外适宜的条件下,能表达菌毛,非致病性菌株不表达。不同菌株的血凝谱及血凝方式具有差异,除中等致病性菌株ＭＧ３０e对大鼠红 细胞（ＲＢＣＦ）的凝集不能被Ｄ－甘露糖抑制,表现为抗甘露糖型血凝（ＭＲＨＡ）外,     

一株鸡大肠杆菌1型及P型菌毛蛋白结构基因的克隆

据国外发表的人病性大肠杆菌１型及Ｐ型菌毛蛋白结构基因（ｐｉｌＡ、ｐａ;ｐＡ）＿序列,设计并合成 于ＰｉｏＡ及ｐａｐＡ保守区的２对引物。经ＰＣＲ从１株带有甘露糖敏感血凝特性（ＭＳＨＡ）及甘露９糖抵抗血凝特性（ＭＲＨＡ）的鸡致病性大肠杆菌（ＨＪ２０ｅ）染色体中扩增到大小分别在６５７ｂｐ、５４ｌｂｐ的２种阳性产物。通过核酸序列测定分别确证所扩增的ＤＮＡ片段分别为ｐｉｌＡ、ｐａｐＡ基因。经酶切、连接、转化     

地高辛标记大肠杆菌1型菌毛结构基因核酸探针对鸡大肠杆菌分离株？…

将ＰＣＲ扩增的鸡大肠杆菌１型菌毛蛋白结构基因（ｐｉｌＡ）用地高辛标记成核酸探针与分属２８个血清型的５０个鸡大肠杆菌分离株进行斑点杂交，阳性率达８４％，用甘露糖敏血凝试验（ＭＳＨＡ）检测阳性率为７２％，表明核酸杂交比ＭＳＨＡ法更敏感。     

用单抗介导的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气管炎病毒的研究

用传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、ＡＲＫ、澳大利亚Ｔ株、野外分离株ＲＳ、ＲＹ及鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）、减蛋综合症病毒（ＥＤＳＶ）等分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，３７℃孵育４８小时后，将其尿囊液离心，沉淀用ＰＢＳ悬浮，涂片，用抗ＩＢＶ单抗ＭＣ作一抗、进行间接荧光抗体检测。结果：Ｈ１２Ｏ、Ｈ５２、Ｍ４１“ＡＲＫ、Ｔ株及ＲＳ、ＲＹ均显阳性，而ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＥＤＳＶ均为阴性。结果表明、用此法检测鸡胚尿囊液中ＩＢＶ．具有快速、敏感、特异的优点。     

鸡源大肠埃希氏菌的分离及生物学特性研究

从福建省几个大肠杆菌病较严重的大型养鸡场分离到的８５株大肠埃希氏菌,从致病性试验、生化试验、药敏试验及生物学我试验结果表明,其中有５２株为致病菌,致病菌分离率６１．１％;分离菌株的生化特性符合大肠埃希氏菌的生化特性;所有菌株均能凝集鸡的红细胞,并能被Ｄ－甘露糖所抑制;对人、猪、山羊、乳牛、兔、犬、豚鼠、鸽和鱼的红的细胞表现为不同的血凝（ＨＡ）和Ｄ－甘露糖血凝抑制特性;２４株强致病菌中有７９．２％的表现为盐凝集试验（ＳＡＴ）阳性：所有菌株对丁胺卡那霉素（ＡＫＮ）和菌必治敏感,对氯霉素（ＣＭＰ）、先锋霉素（ＣＴＮ）、卡那霉素（ＫＡＮ）、呋喃妥因（ＮＩ）、氟嗪酸（ＯＦＬ）、壮观霉素（ＳＰＴ）、妥布霉素（ＴＯＢ）、新霉素（ＮＥＯ）、氟哌酸（ＮＯＲ）、复合磺胺（ＳＸＴ）和强力毒素（ＤＯＸ）有较高敏感性,而对红霉素（ＥＲＹ     

用鸡气管上皮细胞粘附─间接ELISA评价鸡源大肠杆菌致病性

用鸡气管上皮细胞粘附＿间接ＥＬＩＳＡ评价鸡源大肠杆菌致病性恽时锋（南京军区南京总医院动物实验科２１００２）郑明球蔡宝祥（南京农业大学动物医学院）采用１日龄鸡气管上皮细胞作为抗原包被ＥＬＩＳＡ板，分别用大肠埃希氏菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）单因子血清与鸡源Ｅ．ｃ...     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相     

抗鸡致病性大肠埃希氏菌O88单克隆抗体的研究

用纯化的鸡致病性大肠埃希氏菌Ｏ８８菌株（ＭＧ３８ｅ）热灭活抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ雌性小鼠,再用该菌株粗提的脂多糖尾静脉注射加强免疫后,取其脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合,经有限稀释法克隆,用间接ＥＬＩＳＡ及凝集试验（ＩＨＴ）筛选,获得４株能稳定分泌该菌株单克隆抗体的杂交瘤细胞。哪样我瘤细胞培养液ＥＬＩＡＳ和ＩＨＴ效价分别为１：１００～１：１０００和３ｌｏｇ２～４ｌｏｇ２;腹水效价分别为１：１００～１：４     

鸡源大肠埃希氏菌某些生物学特性

对鸡源大肠埃希氏菌的某些生物学特性进行了研究,包括对１日龄鸡的致病性、溶血性、菌毛的表达、血凝性、对鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）的粘附特性、体内外与鸡气管粘膜的粘附特征、质粒特征、全菌蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及免疫转印等。结果表明,鸡源大肠埃希氏菌的溶血性、质粒特征、对ＣＥＦ的粘附特性与其致病性无关;菌毛与致病性有关,大部分菌株表达Ⅰ型菌毛;血凝能被Ｄ－甘露糖抑制,不同菌株血凝谱具有差异;体内外与气管粘膜的粘附特性与菌株致病性有关;在全菌蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳中,相对分子质量约为４０７００的多肽仅存在于具有致病性的菌株中,经免疫转印证实,该多肽为致病性大肠埃希氏菌所特有     

应用反转录—聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）和鸽副粘病毒Ｆ基因的保守序列，设计合成１对引物ＸＺ９、ＸＺ１０，用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对３种株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物，而对鸡传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性；ＲＴ－ＰＣＲ最低能检出１ｐｇ的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板。     

禽流感RT-PCR诊断法的建立

根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法。应用此法对鸡胚培养的ＡＩＶ尿囊液、ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩散试验和电镜技术作了对比。特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合征病毒（ＥＤＳ－７６Ｖ）等的感染鸡胚尿囊液作为对照。结果表明,ＡＩＶ尿囊液ＲＴ－ＰＣＲ全部阳性,ＳＰＦ感染鸡粪便８７份,ＲＴ－ＰＣＲ检出６９份阳性,样品处理浓缩后琼脂扩散检出１１份,电镜检测了２３份样品,仅检出２份阳性。非特异性对照样品经ＲＴ－ＰＣＲ检测全部阴性。将ＡＩＶ感染鸡胚尿囊液作１０倍系列连续稀释,可检出稀释度为１０－２的病毒尿囊液。ＲＴ－ＰＣＲ最早检出时间为感染后第３天,而琼扩和电镜均是７天。该法具有高度的特异性和灵敏性,且节约时间（只需８小时左右）,可从分子水平上对ＡＩＶ进行早期快速诊断和流行病学调查     

禽流感RT—PCR诊断法的建立

根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法,应用此法对鸡胚培养ＡＩＶ尿囊液,ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩莠试验和电镜技术作了对比,特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）,传染性氏囊病病毒（ＩＢＤ     

套式反转录—聚合酶链反应检测恙螨及鼠肺内肾综合征出血热病毒RNA

选择覆盖肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）膜蛋白（ＭＰ）基因的保守区核苷酸序列合成２对引物,采用异硫氰酸胍一步抽提ＲＮＡ,建立了ＲＴ－ＰＣＲ检测鼠体恙螨及游离恙螨体内ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的方法,扩增产物经凝胶电泳及斑点印迹杂交证实具有特异性。结果显示,ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５０只组、１０只组、游离螨５０只组,ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠肺１０００ｍｇ、５００ｍｇ组经ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性;ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体恙螨５只组,ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠体恙螨５０只和１０只组,游离螨１０只和５只组,鼠肺ＨＦＲＳＶ抗原阳性１００ｍｇ组均未见有明显扩增带。进一步用套式反转录－聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ）检测,在ＲＴ－ＰＣＲ未测出ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ的各组中均检测有ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ。结果表明ＮｅｓｔｅｄＲＴ－ＰＣＲ具有高特异、高敏感的特点,可用于检测恙螨体内微量ＨＦＲＳＶ－ＲＮＡ,为确认恙螨作为ＨＦＲＳＶ的传播媒介提供了分子生物学证据。     

微量PCR检测鸡马立克氏病病毒早期感染

为了建立一种监测鸡群马立克氏病病毒（ＭＤＶ）早期感染的微量ＰＣＲ方法,根据血清Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）基因组ＢａｍＨＩ－Ｌ片段的核酸序列设计了１对寡核苷酸引物,用含０．３ＵＴａｑ酶的１０μＬ反应体系分别扩增了ＭＤＶ１型（京－１株、ＭＤ１１／７５ｃ株）、ＭＤＶ２型（ＳＢ－１株）和ＨＶＴ（ＦＣ－１２６株）的核酸,并用京－１株感染细胞ＤＮＡ作了敏感性试验。结果显示,该引物对ＭＤＶ１型病毒特异,京－１株和ＭＤ１１／７５ｃ株都扩增到４２５ｂｐ的核酸条带,而ＳＢ－１株、ＦＣ－１２６株和正常ＣＥＦ细胞的ＤＮＡ都没有得到任何条带;敏感性试验结果表明,微量ＰＣＲ能够检测到０．１ｐｇ的京－１株感染细胞ＤＮＡ;对京－１株感染鸡,在接种后第５天就能在血液细胞中检测到ＭＤＶＤＮＡ。微量ＰＣＲ可望成为监测鸡群ＭＤＶ早期感染的一种快速、有效的方法。     

鸡溶菌酶基因3＇端MAR在同源细胞系对基因表达调控的研究

用带有鸡溶菌酶基因增强子（Ｅ）和启动子（Ｐ）的编码细菌氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）的融合基因（ＥＰＣ），在其上游区、下游区或在上游和下游区同时插入鸡溶菌酶基因３＇端核基质附着区（ＭＡＲ）的不同表达载体ＭＥＰＣ、ＥＰＣＭ和ＭＥＰＣＭ，稳定转染鸡ＨＤ１１Ｐｒｏｍａｃｒｏｐｈａｇｅ同源细胞系，筛选不同表达载体稳定整合后的细胞株，检测ＣＡＴ表达水平，确定其表达基因拷贝数，从而分析鸡溶菌酶基因３＇端ＭＡＲ对基因表达的影响。稳定整合表达和瞬时表达实验结果表明，鸡溶菌酶基因３＇端ＭＡＲ在同源细胞系对基因表达没有激活作用，与该基因５＇端ＭＡＲ在同源或异源细胞系中能激活基因表达形成鲜明对照，说明５＇瑞ＭＡＲ和３＇端ＭＡＲ在调节鸡溶菌酶基因表达上存在一种协调关系。     

PCR方法快速检测鸡传染性支气管炎病毒

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性ＰＣＲ方法。通过对纯化后ＩＢＶ核蛋白基因进行直接ＰＣＲ及套式ＰＣＲ扩增表明,两次ＰＣＲ产物的大小为０．７ｋｂ和０．５ｋｂ,与实际设计相符。而对照的ＮＤＶ及ＩＢＤＶ的ＰＣＲ扩增产物均为阴性。用 ＩＢＶ ＨＢ株感染 ＳＰＦ鸡后,应用我们所建立的 ＰＣＲ方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的 ＩＢＶ,在 ＳＰＦ鸡感染 ＩＢＶ后的２１天仍然能够检测到 ＩＢＶ的基因组,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ杂交试验证明了我们获得的 ＰＣＲ产物为ＩＢＶ的核蛋白基因。该ＰＣＲ检测方法比免疫荧光抗体（ＦＡ）法更具敏感、特异、快速等特点,完全适用于不同来源及不同血清型ＩＢＶ的检测。     

RT-PCR快速诊断禽流感

根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果,设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物,不经病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸, ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出 ３２６ｂｐ的 ＮＰ基因片段。采用该技术对１４个亚型禽流感病毒标准参考株,４个亚型１２株国内分离野毒株,ＲＴ－ＰＣＲ检测的结果都呈阳性;对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒,ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果都呈阴性。禽流感病毒 Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（Ｈ５Ｎ１）和 Ａ／Ａｆｒｉｃａｎ　Ｓｔａｒｌｉｎｇ／Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ１）实验感染鸡样品 ＲＴ－ＰＣＲ检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为３４／４２、３２／４２; ２４／５５、２４／５５, 二者符合率大于９５％。 ＲＴ－ＰＣＲ最少可检测到１０ｐｇ的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行ＲＴ－ＰＣＲ检测,只用６个小时就可得出准确的诊断结果,证明ＲＴ－ＰＣＲ检测方法敏感特异,可用于禽流感的快速诊断。     

核基质附着区(MAR)调控的人胰岛素样生长因子(hIGF-1)转基因兔的制备

用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。     

用单抗介导的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气管炎病毒的研究

用传染性支气管炎病毒Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、ＡＲＫ、澳大利亚Ｔ株、野外分离株ＲＳ、ＲＹ及鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒，减蛋综合症病毒等分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，３７Ｃ孵育４８小时后，将其尿囊液离心，沉淀用ＰＢＳ悬浮，涂片，用抗ＩＢＶ单抗ＭＣ作一抗，进行间接荧光抗体检测。结果：Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１“ＡＲＫ、Ｔ株及ＲＳ、ＲＹ均显阳性，而ＮＤＶ、ＴＢＤＶ、ＩＬＴ     

表达CPB—ST融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜菌β－毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＥＣＢ－ＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体和经甲醛灭活的工艺菌株全菌体制备抗原免疫小白鼠,攻毒试验结果表明,免疫小白鼠能分别抵抗１ＭＬＤ的Ｂ型产气荚膜梭菌强毒株和产ＳＴ的大肠埃希氏菌工程菌株ＨＢ１０１（ｐＳＬＭ００４）的攻击。