本氏针茅SRAP PCR反应体系的建立及引物筛选

以本氏针茅（Stipa bungeana）幼嫩叶片为材料,建立适合本氏针茅基因组DNA提取的改良CTAB法,在此基础上采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,对本氏针茅SRAP PCR反应体系中的5个主要因素（DNA、Taq酶、dNTPs、Mg2+和引物）进行优化,旨在建立适合本氏针茅SRAP分析的反应体系。结果表明,在20 μL总的反应体系中各组分的加入量分别为：DNA（20 ng·μL-1）3 μL、Taq DNA酶(5 U·μL-1)0.2 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1)1.4 μL、引物（10 μmol·L-1）1.0 μL、Mg2+ (25 mmol·L-1)2.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 8.9 μL。体系验证和引物筛选试验表明,该体系适于本氏针茅遗传多样性分析,该体系的建立可为本氏针茅种质资源遗传多样性研究和黄土高原植被恢复及生态建设提供理论基础。     

克氏针茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对克氏针茅ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA、Mg2 、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,确立了适合克氏针茅ISSR分析的优化反应体系。在25μL反应体系中各反应成分为:模板DNA 50 ng,Mg2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,10×buffer 2.5μL。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行克氏针茅遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

灰色家鸽ISSR反应体系的建立与优化

本研究旨在通过正交优化得出灰色家鸽的ISSR-PCR反应的最佳体系。以灰色家鸽为试验材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择,建立了适合灰色家鸽的ISSR-PCR分析的最佳体系。结果表明,灰色家鸽ISSR-PCR反应的最优体系为:25 μL总体积中包括10×PCR Buffer 2.5 μL, Mg²⁺ 2.6 mmol/L, dNTPs 0.2 mmol/L, 引物0.4 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U,DNA 模板1.2 ng/μL,最佳退火温度为56.2 ℃。通过对ISSR-PCR反应体系的优化,能为利用该技术进行灰色家鸽遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析奠定基础。     

利用正交设计优化羊食道口线虫SRAP-PCR反应体系

本研究利用正交设计L16(4)对羊食道口线虫SRAP-PCR反应体系的4因素:Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物进行摸索。结果表明:各因素的不同水平对SRAP-PCR反应结果都有显著的影响,正交设计组合4中扩增的条带最清晰;羊食道口线虫SRAP-PCR最佳反应条件:最佳引物给合为Me1/Em7,最佳反应体系为25μL:2.5μL 10×PCR buffer、20 ng模板DNA、Mg2+(25 mmol/L)3μL、dNTPs(2.5 mmol/L/μL)3μL、引物(10 pmol/μL)4μL、rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、灭菌ddH20补足。本研究结果为进一步采用SRAP技术来研究食道口线虫遗传进化奠定了坚实基础。     

东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化

以东方蜜蜂(Apis cerana)为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模版DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25IX L反应体系中最适含量为:10×PCR buffer 2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.4 pmol/μL引物,20～40 ng模板DNA.PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52.3℃(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,72℃再延伸5 min,在4℃保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.     

红三叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验设计,对影响红三叶ISSR-PCR反应较大的4个因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP及引物)在4个水平上进行筛选,建立并优化了适合红三叶ISSR分析的最佳反应体系。在25μL反应体系中各反应物的最适含量为40ng模板DNA,10×PCR-buffer 2.5μL,2.5 mmol/L Mg2+,2.5UTaq DNA聚合酶,引物1μmol/L,0.2mmol/L dNTP。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,引物退火30s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸7min,4℃保存。优化体系的建立为采用ISSR分子标记技术进行红三叶种质资源遗传多样性分析提供了技术参考。     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+, dNTPs,引物, Taq DNA 聚合酶及DNA 模板浓度进行优化。结果表明,适于杨桃研究的SCoT-PCR最佳反应体系为：总体积为20μL的反应体系中,含2.5mmol/L Mg2+,0.3mmol/L dNTPs,30mg/L模板DNA,1.00μmol/L引物和0.4U Taq DNA聚合酶。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

皖北猪的随机扩增多态DNA研究

为保护和开发地方品种猪的遗传资源,采用随机扩增多态DNA(RAPD)法分析皖北猪个体之间的遗传多样性。试验方案采用L(35)正交法,优化RAPD反应条件;筛选7条特异引物对皖北猪进行RAPD分析,计算带谱相似率、平均杂合度和遗传相似度,UPGMA法进行聚类分析。试验结果表明,优化的皖北猪RAPD反应体系为Mg2+浓度3 mmol/L,Taq酶1.50 U,dNTPs浓度0.40 mmol/L,引物浓度0.50μmol/L,模板浓度1 mg/L。皖北猪群处于亲缘关系不清的遗传非均衡状态。     

马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化

根据正交试验设计原理,设计探索正交试验和细调正交试验以确定马蔺(Iris lacteal Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz)ISSR-PCR反应体系中各成分的浓度,从dNTP、Taq酶、Pri mers、Mg²⁺4种因素对马蔺ISSR反应体系进行了优化,得到适合马蔺的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有dNTP 0.3 mmol/L、Taq酶1.5 U、Pri mers 0.4μmol/L、Mg²⁺2.5 mmol/L以及1×buffer和50 ng模板DNA。通过对马蔺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为52℃。这一体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究马蔺遗传多样性奠定了基础。     

珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化研究

以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系:模板DNA为4ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH2O补足25μL;94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min,扩增结果稳定。     

不同秋眠性苜蓿SRAP体系优化及遗传多样性分析

用改良CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取苜蓿基因组DNA,用L₁₆(4⁵)正交设计,研究了模板DNA、dNTPs、Mg²⁺、Taq酶和引物的浓度对扩增迁移率重现性的影响,结果表明,在20 μL体系中含有50 ng DNA、1.4 mmol/L Mg²⁺、1.2 U Taq酶、0.4 mmol/L dNTPs和0.25 μmol/L浓度的引物最为稳定,重现率达到100%。利用最佳体系从100对引物中筛选出8对在34个苜蓿上扩增效果好的引物,共扩增出87个SRAP标记,有84个多态性位点。聚类分析结果表明,来自安徽和江苏两地的野生南苜蓿和其他栽培苜蓿的遗传差异最大,单独聚为一类;其他32个苜蓿品种在相似系数0.68附近聚为3个亚群,秋眠型苜蓿品种主要分布在第2个亚群中,半秋眠和非秋眠型苜蓿品种分布散乱,并不表现出成族分布,表明秋眠性与苜蓿的亲缘关系不完全一致。     

百脉根ISSR-PCR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对百脉根ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化实验,通过不同反应体系扩增效果比较,最终确定在20uL体系中各反应物的最适含量为:40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/LdNTPs、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA聚合酶。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行百脉根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20 μL)为:15 ng模板DNA, 0.15 mmol·L^-1dNTP, 0.5 μmol·L^-1ISSR引物, 1 U Taq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

桑天牛遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立

建立适合的AFLP反应体系研究桑树主要害虫桑天牛(Apriona germari)的遗传多样性,有助于从分子水平分析桑天牛不同地理种群的遗传多样性以及开辟害虫防治新途径。对提取的桑天牛成虫基因组DNA预扩增中的Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量以及选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度和Taq酶的用量等进行单因素试验,优化反应体系。确定预扩增反应体系中的Mg2+终浓度为1.50mmol/L,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为10.0×10-7mol/L,Taq酶用量为1.00U;确定选择性扩增反应体系中的预扩增产物稀释倍数为40倍,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为5.00×10-7mol/L,Mg2+终浓度为1.50mmol/L,Taq酶用量为1.00U。用优化后的反应体系扩增得到了条带清晰的桑天牛AFLP图谱。