转基因耐除草剂大豆ZH10-6实时荧光定量PCR检测方法的建立

转基因耐除草剂大豆ZH10-6是含有G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草剂大豆新品系,对广谱型除草剂草甘膦具有耐受性,在中国具有重要产业化应用前景.本研究以其转化体特异性序列为靶标,建立了基于Taqman水解探针的实时荧光定量PCR检测方法.该方法能特异、定量检测出转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体成分,线性度大于...     

玉米转基因成分三重实时荧光PCR筛选检测

本研究开发建立了三重实时荧光PCR反应体系对玉米及其加工制品的转基因成分进行高通量快速检测。以玉米单拷贝内源基因adh1(编码乙醇脱氢酶的基因)、启动子(35S promoter from cauliflower mosaic virus, p-35S)和t-NOS终止子(terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens, t-NOS)等常用转基因元件为靶标基因,以转基因玉米MON863、NK603、MON810、Bt11,非转基因玉米粉2019054以及转基因大豆粉,棉花籽和小麦粉等非玉米农作物样本共8份测试样品进行方法特异性分析,对10个玉米品系种子样本和41份玉米食品样品进行方法适用性分析和日常样本筛查检测,用标准曲线法验证方法的检测低限和重复性。结果表明该体系能在转基因阳性样本DNA为模板的一个反应管中同时检出3个靶标基因,在非转基因的玉米样本中仅检出内源基因,检测结果符合标示值;adh1、p-35S和t-NOS三种靶标基因扩增效率分别为96.84%、94.92%和93.80%,线性相关系数分...     

实时荧光PCR定性检测菜籽粕中转基因成分的研究

本文针对使用实时荧光PCR对深加工的饲料菜籽粕进行转基因检测的研究,就DNA抽提、纯化和实时荧光PCR过程中使用样品DNA的最适浓度等方面,对检测方法进行了适当的改进,并探讨了如何根据所得荧光曲线的Ct值判定菜籽粕中是否含有转基因成分.     

实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究

以转基因大豆Roundup Ready为材料，通过特异性引物和探针，对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测。研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法，但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度，其检测阈值可降到0.05%，变异系数为0.09%~0.53%。在此基础上，建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系，有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性。     

以实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米MON88017

根据转基因玉米MON88017的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及Taqman探针,通过实时荧光PCR技术建立MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子,建立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了5个已知MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%)的混合样品中的转基因含量,结果表明检测底限可以达到19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强。     

基于TaqMan实时荧光PCR技术快速筛查转基因玉米

随着全球转基因玉米种植面积日益扩大,快速筛查转基因玉米技术需求与日俱增.本研究以转基因玉米混合样品(1％,0.5％,0.1％,0.05％,0.01％)为试验材料,应用TaqMan real-time PCR和毛细管荧光检测电泳技术对转基因的2个元件CaMV35S启动子和NOS终止子进行检测.结果 表明两种检测技术均可筛查玉米中转基因成分,TaqMan real-time PCR技术检测灵敏度可以达到0.01％,比毛细管电泳荧光检测技术高约50倍.TaqMan实时荧光PCR技术具有更简便、高效等特点,为快速筛查转基因玉米提供技术支持.     

基于实时荧光定量PCR对转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测

转基因植物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术并以番茄抗坏血酸过氧化物酶apx(ascorbate peroxidase)基因和光诱导的早期蛋白elip(early light inducible protein)基因为内参开展对12株转基因樱桃番茄外源基因拷贝数的检测。研究结果表明:常规番茄使用的内参基因apx在樱桃番茄中可能以多拷贝形式存在;以elip基因为内参检测到转基因植株内整合的拷贝数为0~20不等,其中4株在普通PCR检测中存在假阳性,且80%的转基因植株发生了基因重排现象。     

实时荧光PCR检测马铃薯白线虫技术研究

马铃薯胞囊线虫是马铃薯上最重要的有害生物之一,也是我国特别关注的重要植物检疫性线虫.针对马铃薯白线虫ITS序列,我们设计了引物和TaqMan探针,使用15种马铃薯胞囊线虫群体和4种其它胞囊线虫样品进行验证,可高度灵敏地检测单个马铃薯白线虫的胞囊或幼虫,最高检测灵敏度达到10fs;同时开展了混合样品和未知样品的检测,证明了引物的专化性和TaqMan探针特异性.该检测方法可自动化检测马铃薯白线虫并进行定量,适合进行标准化的常规检测.     

定量PCR技术检测转基因玉米的研究

以Bt176转基因玉米为材料,通过使用特异性引物和染料,对转基因玉米中外源基因cry1Ab进行了定量检测。研究发现,在优化检测体系的基础上,SYBR荧光染料法定量检测转基因玉米,具有更高的检测灵敏度和精确度,其检测阈值可降到0.05%,变异系数为0.09%~0.53%。     

巢式PCR和SYBR Green I实时PCR检测转基因大豆方法的研究

为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green I实时PCR技术,检测转基因大豆 外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS).结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1％　的大豆中　的CaMV35S基因,而轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green I染料能结合双链DNA的 特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解 曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL.同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分.巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限, SYBR Green I实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分.     

转基因抗虫玉米的定量检测

建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为：3.13%、1.09%、0.53%（SYBR Green I法）和3.07%、1.02%、0.50%（Taqman探针法）,RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。     

不同浓度盐胁迫对转基因饲用甜菜种子萌发及幼苗生长的影响

通过不同浓度NaCl溶液处理转基因饲用甜菜种子及其幼苗试验，研究了盐胁迫下种子萌发、幼苗生长及胁迫解除后种子的效应，为盐土农业生产提供理论依据。结果表明，转基因饲用甜菜种子萌发的适宜Nacl浓度为50。150mmol/L，其中100mmoL／LNaCl胁迫下，种子发芽率最高，与对照相比高6．78％。随着盐胁迫浓度的升高，种子萌发延迟，萌发率也呈不同程度的降低。盐胁迫解除后，种子萌芽迅速，萌芽率提高，整齐度增加。转基因饲用甜菜幼苗在不同NaCl浓度胁迫下表现出的反应不同，高盐胁迫对抑制幼根生长影响较大。     

转耐盐基因水稻的PCR检测方法及其分子辅助育种

研究采用改良CTAB法和磁珠自动提取法提取水稻种子基因组DNA,通过对水稻内源SPS基因、ThST3和Ubiquit-in启动子间构建特异序列进行PCR扩增,扩增产物结合排枪凝胶电泳实现快速检测。其中PCR扩增内源SPS基因的结果表明,采用改良CTAB法和磁珠自动提取法可用于市售水稻种子和转基因种子的DNA提取。实验合成的构建特异引物以及建立的PCR扩增反应体系能特异性地检测转耐盐基因水稻Theli。该方法检测灵敏度高,绝对检测低限达17.3×10-2ng,相对检测低限为0.41%,能有效地对转基因水稻ThST 3进行鉴定;稳定性好,可完全满足转基因水稻的定性检测、监督和标识管理需要。同时可用于对转基因水稻的辅助选择(MAS)育种。     

转基因水稻的安全性问题及其检测方法

自1988年第1批转基因水稻问世以来,经过20年的发展,已经开发出了许多有价值的转基因水稻品种,有些已开始商业化种植并被批准环境释放。综述了转基因水稻的发展现状、安全性问题及其常用检测方法。     

不同检测方法对甜菜ISSR引物多态性的影响

为了探讨不同检测方法对甜菜ISSR引物扩增效果的影响以及各方法的优缺点,笔者应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳两种检测方法对甜菜ISSR 引物扩增效果进行了检测。利用12个不同的甜菜品种,对10 个ISSR引物进行扩增,分别采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、1%的琼脂糖凝胶电泳以及2%的琼脂糖凝胶电泳对ISSR-PCR的扩增产物进行分离。结果表明：6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳无论是检测的总条带数还是多态性条带数均远高于琼脂糖凝胶电泳,且条带清晰,易于识别,而2%的琼脂糖凝胶电泳检测的条带数高于或等于1%的琼脂糖凝胶电泳,且条带更易于识别,因此,对于利用ISSR 引物进行QTL定位、指纹图谱构建以及遗传多样性分析时,推荐使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,而对于种子纯度鉴定以及需要对ISSR扩增产物进行测序,则推荐使用2%的琼脂糖凝胶电泳。     

转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法研究

本研究建立了转基因耐除草剂大豆A2704-12定性PCR检测方法.根据A2704-12转化体外源插入片段5'端与大豆基因组连接区序列设计特异性引物,以大豆内源基因Lectin为内标,从A2704-12转化体中特异性扩增出239 by大小的特异性目的片段.同时对该方法特异性和灵敏度进行测试,结果显示:该方法能检测出A27...     

肉毒梭菌的荧光定量PCR检测方法

根据肉毒梭菌神经毒素基因设计的引物和探针,建立了肉毒梭菌荧光定量PCR快速检测方法。肉毒梭菌产生了典型的"S"型曲线,其他干扰菌都无扩增,说明引物特异性较好,检测灵敏度为1×103 cfu/mL。该方法能够实现肉毒梭菌的快速检测,具有灵敏度高、特异性好的特点。     

应用纳米磁珠荧光PCR检测棉花曲叶病毒

 为了提供快速灵敏检测棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus, CLCuV)的技术以防止其传播扩散,本研究根据CLCuV外壳蛋白基因（Coat protein, CP）保守序列设计了引物和TaqMan探针,并结合纳米磁珠(Magnetic nanoparticles, MNPs)建立了该病毒的MNP实时荧光PCR (Real-time PCR)检测方法。该方法检测阈值约为525 fg·μL^-1 DNA。通过对CLCuV、非洲木薯花叶病毒、烟草线条病毒、黄瓜花叶病毒及番茄斑萎病毒的检测表明,该方法具有良好的特异性;同时该方法无需任何PCR后处理,交叉污染风险小。本方法可用于CLCuV的快速检测。