肉羊CYP19基因C242T位点多态性研究

试验旨在研究芳香化酶(CYP19)基因C242T位点多态性,对4个肉羊品种CYP19基因多态位点等位基因频率和基因型频率进行分析。试验选取巴西马林加的4个绵羊品种(杜泊羊、圣伊内斯羊、特克塞尔羊、白杜泊羊)187只,采集血样,采用碱性裂解法提取基因组DNA,并用特异性引物对CYP19基因片段进行扩增,PCR扩增产物经Dpn Ⅱ内切酶酶切后进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色。分型结果显示,CYP19基因C242T位点存在3种基因型:CC、CT、TT。用POPGENE软件对所得数据进行分析,P<0.05为差异显著性判断标准。4个肉羊品种CYP19基因C242T位点的基因型频率分别为:特克赛尔羊(CC,0.426;CT,0.511;TT,0.064)、杜泊羊(CC,0.073;CT,0.732;TT,0.439)、白杜泊羊(CC,0.021;CT,0.255;TT,0.723)和圣伊内斯羊(CC,0.115;CT,0.462;TT,0.423)。     

自贡黑山羊GoLA-DRB3基因遗传多态性的研究

采用PCR-RFLP技术分析并比较自贡黑山羊、金堂黑山羊、乐至黑山羊和成都麻羊GoLA-DRB3基因区域第二外显子的遗传多态性,其特异性扩增产物经TaqⅠ、Pst Ⅰ和HaeⅢ限制性内切酶酶切,结果GoLA-DRB3基因的第二外显子的第122、154、168、220、241位碱基均为多态.自贡黑山羊3种酶切共检测到GoLA-DRB3基因的9个等位基因;金堂黑山羊3种酶切共检测到GoLA-DRB3基因的10个等位基因;乐至黑山羊3种酶切共检测到GoLA-DRB3基因的7个等位基因;成都麻羊3种酶切共检测到GoLA-DRB3基因的8个等位基因.聚类表明,金堂黑山羊和成都麻羊的亲缘关系最近,在D=0.282处首先聚为一类,两者再与乐至黑山羊在D=0.351处聚为一类;最后自贡黑山羊与前3个山羊品种在D=0.498处聚为一类.     

微卫星标记BMS2508和Bulge5在河南淮山羊中的遗传多样性研究

<正>用2个微卫星标记,通过PCR扩增,利用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色等方法对河南淮山羊进行微卫星DNA遗传多态性进行研究。结果显示:在Bulge5基因座上检测出6个等位基因,其片段大小在105～140bp之间,其多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)     

聚合酶链反应原理与操作(下)

5 扩增产物的测定和寡核苷酸探针扩增的 DNA 或在电泳过程后用溴化乙锭染色直接检出或与特异 DNA 探针杂交来检出。凝胶分析和两个杂交方法的优缺点列于表1中。直接凝胶电泳检出法简单,将扩增的 DNA 产物直接上样于琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上,通过电泳分离,样品 DNA 可与已知大小的溴化乙锭染色后可见的 DNA 比较。但此法的不足之处:一是不敏感,许多阳性样品虽然可能有被扩增的 DNA 产物,但其量不足以用来直接显现;二是缺乏序列特异性,非特异的 DNA 也能被扩增,而且它们的泳动率和特异的扩增产物相似,因此,凝胶     

应用Cas9 RNPs进行绵羊FecB基因型检测的可行性研究

为了研究Cas9 RNPs用于绵羊FecB基因分型的可行性，试验以FecB基因BB、B+、++型的绵羊个体为试验动物提取基因组DNA。基于Cas9 RNPs的体外DNA定点内切酶活性，用FecB基因靶位点的特异性引物扩增产物作为底物，利用大肠杆菌共表达纯化获得Cas9 RNPs,对不同FecB基因型目标样本进行酶切检测。结果表明：SDS-PAGE电泳结果显示，在130～180 kD之间有一条与预期大小相符的特异蛋白条带；3种基因型的靶DNA均被切割为185 bp和368 bp两个片段；绵羊FecB++型成纤维细胞Cas9 RNPs电转染的突变检测结果显示，纯化的两个Cas9 RNPs都具有基因组编辑活性。说明本研究获得的Cas9 RNPs在体外和细胞内都具有良好的酶活性，但未能区分绵羊FecB基因型。     

牛4-细胞期胚胎mRNA的RT-PCR检测

凝胶银染法快速检测RT-PCR产物,有利于研究附植前胚胎的基因.选择体外培养的牛单个附植前胚胎,以锚定引物和随机引物RT-PCR扩增,用不同浓度聚丙烯酰胺凝胶在不同电压条件下电泳,2 g/L硝酸银染色,可以直接观察到大小不同的电泳条带,扩增的片段大多数在500 bp以下.研究表明,60g/L聚丙烯酰胺凝胶90 V电压电泳,电泳条带之间具有适当的距离,有利于差异条带分离和回收,是一种分离和检测DNA的有效方法.     

马DRD4基因部分序列克隆和PCR-RFLP分析

克隆了马DRD4基因完整第1内含子及部分第1、2外显子序列,并用StuⅠ限制性内切酶通过PCR-RFLP技术检测了包括引入品种、培育品种和地方品种6个类型共270匹马的DRD4基因部分序列多态性。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将酶切产物分离,并用银染法显色。结果经StuⅠ内切酶消化表现出多态,由3种共显性等位基因控制,出现了6种基因型;经Hardy-Weinberg平衡检验,乌审马（WS）、巴而虎马（BH）和乌珠穆沁马（WZ）（P〉0.05）达到平衡,而其余均未达到平衡（P〈0.05）。     

扩展莫尼茨绦虫DAZ基因保守结构域所在片段的克隆及原核表达

为了克隆和表达编码扩展莫尼茨绦虫无精症缺失(DAZ)基因,试验根据GenBank中扩展莫尼茨绦虫DAZ基因cDNA序列(登录号为GH291478)设计1对特异性引物,以扩展莫尼茨绦虫组织总RNA为模板,RT-PCR扩增DAZ基因,并克隆到pMD19-T载体中进行序列测定,构建重组质粒pET28a-DAZ,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析表达产物,通过螯合琼脂糖凝胶FF亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明:重组DAZ基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白分子量约为14 ku。     

区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法的建立

根据GenBank登录的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）非结构蛋白（NS）基因特征,本研究设计1对特异性引物对GPV和MDPV基因组DNA进行PCR扩增,目的片段大小均为810 bp,并对PCR产物进行切胶回收。用EcoRⅠ酶对GPV和MDPV特异性胶回收产物进行酶切鉴定,结果显示MDPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段,大小为530和280 bp;而GPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。本研究建立了一种快速区别GPV和MDPV感染的检测方法,可对番鸭感染水禽细小病毒的情况进行快速鉴别诊断。     

犬轮状病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立

目的:建立轮状病毒快速准确的检测方法,为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。方法:用Primer5软件设计VP7引物,从采集的腹泻犬粪便样品抽提病毒RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,将RNA反转录为cDNA,并进行PCR扩增,对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序,与代表株的VP7进行同源性比较。结果:从腹泻病犬粪便样品中抽提到了轮状病毒RNA,反转录后扩增产物为51bp的基因片段,经核苷酸序列分析,其PCR序列与犬轮状病毒VP7基因编码源序列的同源性为86.3%。结论:正确克隆了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区,建立了犬轮状病毒实时定量诊断方法,为研制实时定量诊断试剂盒奠定了基础。     

FecB基因在5个中国地方绵羊品种中的多态性及其与产羔数的关联分析

为解析中国地方绵羊品种产羔数差异形成的遗传学机制,以5个不同繁殖力的中国地方绵羊品种(湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊和多浪羊)为研究对象,利用PCR-RFLP技术检测FecB基因的多态性,比较不同繁殖力群体间FecB的分布情况,并与其产羔数进行关联分析。结果显示:湖羊群体中存在BB、B+、++三种基因型,藏羊、蒙古羊及阿勒泰羊群体中仅存在B+和++两种基因型,多浪羊群体中仅存在++基因型。湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊及多浪羊群体中BB、B+及++基因型频率依次是0.69、0.28、0.03,0.00、0.13、0.88,0.00、0.08、0.92,0.00、0.08、0.92和0.00、0.00、1.00;B等位基因频率由高到低依次为湖羊>藏羊>蒙古羊=阿勒泰羊>多浪羊。湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊中该位点He和PIC分别为0.29、0.25,0.12、0.11,0.08、0.07和0.08、0.07,且在以上4个品种中BB和B+基因型个体产羔数比++基因型个体高(P<0.01),BB基因型个体和B+基因型个体之间无差异(P>0.05)。由此可推断,FecB或许是决定绵羊产羔数的主效基因,亦或是与其存在密切相关的标记基因,可助力绵羊产羔数性状MAS技术和为多胎绵羊新品种(系)培育提供素材。     

伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

根据引物设计的一般原则，参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物，PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收：PCR产物，并将其克隆至pGEM—T Easy载体中，经酶切、PCR鉴定和序列分析，获得重组中间质粒pGEM／HGPRT。重组中间质粒pGEM／HGPRT经Nco I和Sal I双酶切，回收目的片段HGPRT，以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV／HGPRT，转化大肠杆菌DH5a，42℃诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析，表达产物HGPRT的分子量约为23kD，与理论推算值相符，表达率占总菌体蛋白的19％，经间接ELISA检测，表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。     

猪白细胞介素-12的分子克隆与序列测定

为研究白细胞介素-12在机体免疫应答中的作用。从猪外周血提取单个核细胞（PBMCs)，用含LPS的培养基培养细胞，从培养2h和12h的活化细胞中分别提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出编码猪IL-12两个亚基的基因，其大小分别为720bp(P35)和1044bp(P40)，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化，用SacI和SalI双酶切后，分别将其连接至pUC18质粒上，进行质粒PCR和SacI,SalI双酶切鉴定后筛选阳性克隆，并进行序列测定和分析，序列分析表明P35基因开放阅读框含有669个核苷酸，序列与人，小鼠和羊同源性分别为79.2%,37.6%,86.1%,P40基因开放阅读框含有975个核苷酸，与人和小鼠，羊基因序列的同源性分别为79.5%,53.1%,84.3%。结果表明克隆到了猪白细胞介素-12P35和P40两个亚基的基因，得到的P35基因序列与国外报道完全一致，P40基因序列与发表的序列有4个碱基差异，提示P40基因可能存在多态性。     

微卫星PCR产物PAGE与银染改良方法

对湘西黄牛的2个微卫星座位IDVGA44、IDVGA27 PCR,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染。结果表明,在凝胶制备时,采用3%和8%两层凝胶结合的方法,能使电泳条带更加清晰,容易判读。按本文的方法配置试剂和染色,条带清晰,背景着色浅,染色效果理想。     

绵羊生长激素(oGH)的分子克隆与序列测定

本文旨在新疆绵羊生长激素(oGH)基因的克隆。从阿勒泰×中国美利奴杂交羊脑垂体细胞中提取总RNA,分离得到具翻译活性的mRNA。用RTPCR方法扩增出编码oGH的基因,长度为671bp。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,回收纯化。采用PCR克隆试剂盒将扩增产物连接至pTAdv质粒上,经PstI和XbaI双酶切鉴定正反插入后,筛选正向插入阳性克隆,并进行序列分析。结果表明克隆到的oGH基因序列与国外报道的序列有4个碱基差异,但所推导的氨基酸序列完全一致。oGH基因的开放阅读框架共含654个核苷酸,编码217个氨基酸,其中信号肽26个氨基酸,编码碱基为1～78(78bp);成熟肽191个氨基酸,编码碱基为79～651(573bp);终止密码子TAG(652～654bp)。其蛋白质的氨基酸序列与牛、人和鱼的序列同源性分别为99.08%、26.7%和5.9%。     

自贡黑山羊MHC-DRB_3基因的多态性研究

本实验研究了自贡黑山羊、金堂黑山羊、乐至黑山羊和成都麻羊MHC-DRB3基因的多态性。MHC-DRB3第2外显子的PCR扩增产物分别经限制性核酸内切酶TaqⅠ、PstⅠ、HaeⅢ消化,结果在第122、154、168、220、241位碱基显示出多态性;4个山羊群体分别检测到9、10、7个和8个等位基因;聚类分析表明:金堂黑山羊和成都麻羊亲缘关系最近,首先聚为一类,再与乐至黑山羊聚为一类,最后自贡黑山羊与其他3个山羊品种聚为一类。     

展青霉素人工抗原的制备与鉴定

为探讨展青霉素（patulin,PAT）不同抗原合成方法对完全抗原制备及抗体产生的影响,本试验利用琥珀酸酐联合活泼酯法,分别制备免疫原PAT-BSA和包被原PAT-OVA。为提高PAT与偶联蛋白的结合率,尝试将BSA修饰为EDA-BSA后与PAT进行偶联,并对比2种偶联方法制备的完全抗原免疫动物后抗血清的效价水平。同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶渗透色谱多种方法分析鉴定偶联结果,为PAT单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

绵羊FecB基因KASP检测方法的建立及其在肉羊育种中的应用

为了建立绵羊FecB基因检测的竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR,KASP)方法并对检测反应体系进行优化,试验首先采用基因组PCR产物直接测序法筛选BB、B+和++基因型绵羊个体各3只,然后参照KASP原理及基本反应体系对已知FecB基因型个体进行分析,并通过体系优化建立FecB基因KASP检测方法,最后对不同品种羊FecB基因型多态性进行分析。结果表明:KASP技术能够分辨不同FecB基因型;KASP检测体系优化调整幅度不大;杜泊羊不含有FecB基因,纯种德国肉用美利奴羊(德肉美)和东北细毛羊仅含有稀少的B+基因型个体,德肉美与小尾寒羊杂交羊中尽管++基因型仍然为优势基因型,但BB和B+基因型频率稳步提升,且处于Hardy-weinberg不平衡状态。说明在绵羊高繁殖性状育种中用KASP技术检测FecB基因是可行的。     

微卫星标记BM6404和TGLA53在太行黑山羊中的遗传多样性研究

为了研究太行黑山羊品种的遗传多样性,试验采用PCR扩增、12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色等方法对其进行研究。结果表明:微卫星标记BM6404和TGLA53在太行黑山羊上呈现多态性。BM6404基因座有6个等位基因,其片段大小在125～147 bp之间;BM6404基因座多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)、平均杂合度(He)分别为0.725,4.169,0.760。TGLA53基因座有7个等位基因,其片段大小在121～147 bp之间;TGLA53基因座的PIC、Ne、He分别为0.795,5.5280,.819。说明微卫星位点BM6404和TGLA53在太行黑山羊上均为高度多态位点。     

鹅微卫星(TG)_n基序的克隆及序列比较分析

以(TG)10重复基序设计引物对鹅基因组DNA进行PCR扩增,PCR产物经12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测,共获得了7种基因型,4种等位基因;并且在各供试鹅品种上表现出多态性,可以实现遗传分类研究。对回收的不同条带进行纯化、克隆测序;测序结果显示各品种都有(TG)n基序存在,并且各个条带中重复数大于10。