4种蛙皮肤活性肽的提取及生物活性比较

利用80%甲醇和乙醚刺激方法,分别提取了4种两栖类动物皮肤粗提物和分泌物,并进行了生物学活性的测定.结果表明,4种蛙皮肤粗提物具有广谱抗菌活性,其中中国林蛙有轻微的溶血性,牛蛙与美国青蛙粗提物具有胰蛋白酶抑制剂活性;而4种蛙皮肤粗提物均无胰蛋白酶活性,牛蛙、美国青蛙与东北林蛙具有很强的凝集素活性.利用MTT法检测到4种蛙皮粗提物具有抗肿瘤细胞与抗病毒活性.     

光滑爪蟾皮肤抗菌肽的分离纯化及活性检测

通过高效液相色谱法,对光滑爪蟾皮肤分泌物进行分离纯化,得到具有抗菌活性的光滑爪蟾皮肤抗菌肽。通过最小抑菌浓度（MIC）试验、溶血活性试验及癌细胞抑制试验,对其体外生物活性进行研究。结果表明,经过纯化得到2个纯度高且具有活性的抗菌肽（AMP1和AMP2）,质谱鉴定结果得出其相对分子质量分别为1 082.78和2237.34。MIC结果表明,AMP1对S.aureus ATCC25923、Escherichia coli ATCC25922的MIC值分别为23.63、8.71mg/L,对MRSA无抑菌作用。AMP2对S.aureus ATCC25923,Escherichia coli ATCC25922、MRSA的MIC值分别为4.94、10.7、86.6mg/L。溶血试验显示AMP1,AMP2具有极弱溶血活性,且对癌细胞SW480具有抑制作用。     

大肠杆菌胁迫下东北林蛙皮肤抗菌肽分泌特性研究

以东北林蛙(Rana dybowskii)为试验对象,采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为环境胁迫因子,通过RP-HPLC分析、抑菌活性和蛋白浓度比较,观察其皮肤分泌物的特异性分泌,以期揭示两栖类动物抵御环境微生物时皮肤分泌抗菌肽的变化规律。研究发现,用E.coli胁迫1~18d后皮肤分泌物粗提物洗脱峰数量明显减少了61.54%~84.62%,对4个持续出现的8、9、11和14号洗脱峰的抑菌活性试验显示,8、9号峰对G-和G+菌均表现较强的活性抑制,而11、14号峰仅对G+菌有较强的抑菌活性。此外,E.coli胁迫后第7天组皮肤分泌物的洗脱峰数量、持续出现峰的峰面积值及蛋白浓度与对照组比均明显增加,第23天组均恢复至较高水平。研究结果表明:两栖类皮肤抗菌肽可能在参与机体先天免疫系统防御和启动后天免疫应答的关键环节中发挥重要的桥梁作用。     

长沙市黑斑蛙蛔虫pcox1基因的扩增及序列分析

为研究长沙市黑斑蛙蛔虫分离株的线粒体DNA pcox1序列的遗传变异情况,并分析黑斑蛙蛔虫cox1部分序列与其它蛔虫的种群遗传关系。利用PCR扩增黑斑蛙蛔虫mtDNA的pcox1片段,将PCR扩增出的片段纯化后测序,并对其序列进行分析。结果显示所获得的4株cox1序列长度存在一定差异,为400～410 bp。由于黑斑蛙蛔虫cox1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的分子标记。本研究报道的黑斑蛙蛔虫cox1序列,为黑斑蛙蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础。     

一株植物内生放线菌次级代谢产物的提取及抑菌活性研究

通过从兰州百合中分离筛选得到的一株放线菌,且发现该菌株具有抑菌活性。本实验通过发酵来生产次级代谢产物,利用萃取的方法来提取次级代谢产物。用不同溶剂来溶解粗提物以及用菌体进行抑菌活性实验。最后得到该菌株的发酵产物且该产物对多种不同病原菌(如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等)具有较强的抑制作用。     

6种中药水溶性粗提物对鸡源耐药奇异变形杆菌的抑菌活性研究

对获得的91株鸡源奇异变形杆菌进行了11种抗生素敏感性测定,从中筛选出5株耐药性较高的耐药奇异变形杆菌。以奇异变形杆菌标准菌株为模型,进行了31种中药水溶性粗提物抑菌活性研究。以庆大霉素和青霉素为参照,采用管碟法对6种中药水溶性粗提物的抑菌活性进行效价估算。最终将6种中药水溶性粗提物作用于筛选出的耐药奇异变形杆菌,验证其抑菌活性。结果表明,31种中药中地榆、虎杖、大黄、黄芩、大青叶和绵马贯众对奇异变形杆菌标准菌株的抑菌效果最佳,对耐药奇异变形杆菌抑菌效果明显优于试验的11种抗生素。     

家兔不同组织抗菌蛋白活性及稳定性检测

从家兔8种不同组织(包括肝脏,肾脏,心脏,肺,圆小囊,蚓突,脾脏和肾上腺)提取了具有抗菌活性的蛋白粗提物,并进行了抗菌活性和稳定性检测。试验表明,家兔不同组织抗菌蛋白粗提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性,其中脾脏抗菌蛋白粗提物表现出最强的抑菌活性,且具有良好的耐高温和耐强酸强碱特性。     

大口黑鲈不同组织中抗菌肽粗提及抑菌活性测定

研究了大口黑鲈不同组织中抗菌肽的提取及其粗提物对不同菌种的抑菌作用。以新鲜的大口黑鲈为试验材料,用5％乙酸作为提取液,对大口黑鲈粘液、皮肤、肝脏、脾、卵、鳃组织进行提取,并对粗提物进行抑菌活性检测。结果表明大口黑鲈粘液、皮肤和肝脏组织提取物对嗜水气单胞菌有抑菌作用,皮肤和肝脏组织提取物对大肠杆菌有抑菌作用。肝脏组织抗菌肽提取物经SephadexG-25凝胶过滤层析柱分离后,其收集液对嗜水气单胞菌仍具有抑菌作用。大口黑鲈皮肤和肝脏组织提取物对嗜水气单胞菌、大肠杆菌均有抑菌作用。     

黑斑蛙胰岛素样生长因子-2原核表达载体构建

胰岛素样生长因子-2(IGF-2)是介导生长激素发挥生物学功能的重要因子,在动物机体的生长发育中具有重要作用。为对黑斑蛙IGF-2基因进行原核表达,本研究针对转录组数据中的黑斑蛙IGF-2序列,设计引物扩增IGF-2的完整基因,获得了全长为944 bp、ORF长为651 bp的序列;随后在黑斑蛙IGF-2的ORF两端添加限制性内切酶位点后亚克隆到p ET-32a(+)质粒中,构建了黑斑蛙IGF-2的原核表达载体。为获得黑斑蛙IGF-2的表达产物并探究其生物学作用奠定了基础。     

多黏类芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化及特性研究

试验旨在分离纯化多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）BLCC1-0402代谢产物中的抗菌肽,为抗菌肽制备及其制品检测提供参考。采用离心、不同分子质量卷式膜超滤浓缩、Superdex peptide 10/300GL凝胶过滤层析对多黏类芽孢杆菌发酵上清液进行逐级分离纯化,对不同时段的收集液做抑菌试验,以大肠杆菌O78标准菌株为指示菌,采用打孔法进行抑菌活性检测,比较评价分步层析效果,以Tricine-SDS-PAGE进行分子质量检测。结果显示,通过5和3 ku卷式膜超滤获得的3~5 ku组分蛋白质样品抗菌活性较强;对于3~5 ku组分经凝胶过滤层析分离纯化,纯化后的抗菌肽A3抑菌活性最强,经Tricine-SDS-PAGE小分子多肽电泳检测,已达到电泳纯,分子质量为4 ku;抑菌活性检测结果显示,该抗菌肽A3对大肠杆菌O78标准菌株具有较强的抑菌作用。同时,抗菌肽A3表现出较好的耐热性,90~100 ℃处理15 min,抑菌活性可保持在96%左右;具有较好的酸碱稳定性,在pH 2.0~9.0下,抑菌活性保持在90%以上;经胃蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低20%,胰蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低18%,蛋白酶K对抗菌肽A3的抑菌活性几乎无影响。本研究结果表明,分离得到的抗菌肽A3是一种对大肠杆菌O78具有抑菌活性的新型抗菌肽,具有一定的开发潜力,可为下一步抗菌肽的结构分析、理化特性分析等深入研究提供一定参考依据。     

养殖密度对黑斑侧褶蛙生长发育的影响

为提高黑斑侧褶蛙(Pelophylax nigromaculata)养殖效益,探究养殖密度对黑斑侧褶蛙生长发育及两性异形的影响,对3种养殖密度(140,80,55只/m~2)的黑斑侧褶蛙的生长发育进行了比较研究。结果表明:不同养殖密度对黑斑侧褶蛙形态特征的影响显著,85日龄时不同养殖密度蛙的体长、体质量、头宽、前肢长、后肢长出现极显著差异(P<0.01),胫宽和肥满度差异显著(P<0.05),中等养殖密度蛙的各形态学指标显著高于其他养殖密度蛙的形态学指标,中、高养殖密度蛙的肥满度显著高于低养殖密度蛙的肥满度。不同养殖密度的黑斑侧褶蛙的饵料系数差异不显著(P>0.05),特定生长率差异显著(P<0.05),摄食率和质量增加率差异极显著(P<0.01),中等养殖密度蛙的特定增长率、质量增加率较其他两组养殖密度蛙的特定增长率、质量增加率高,低养殖密度蛙的摄食率较其他两组密度蛙的摄食率高。中、高养殖密度黑斑侧褶蛙两性异形(体长、体质量)出现时间较低密度蛙的早,雌雄体长、体质量的差异极显著(P<0.01),雌性体长、体质量均显著大于雄性。以体长为协变量的协方差分析头宽、前肢长、胫宽、后肢长局部性状的两性差异均不显著(P>0.05)。     

基于prrnS基因序列分析黑斑蛙裂头蚴种系发育关系

为研究湖南省黑斑蛙裂头蚴分离株的核糖体(rDNA)小亚基基因(rrnS)部分序列(prrnS)的遗传变异情况,并用所获得prrnS序列构建黑斑蛙裂头蚴与其他绦虫的种群遗传关系。利用聚合酶链反应(PCR)扩增湖南省黑斑蛙裂头蚴的prrnS,将PCR产物进行测序并对其序列进行分析。9株湖南省黑斑蛙裂头蚴分离株的prrnS序列长度均一致,为330 bp。经分析显示,黑斑蛙裂头蚴prrnS序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为蛙裂头蚴的种间遗传变异研究的分子遗传标记。     

重金属污染对稻田共生黑斑蛙毒性影响研究

文章介绍了黑斑蛙生存环境稻田重金属污染情况及毒性机理,详细阐述了重金属对黑斑蛙的毒害效应,并逐一介绍不同重金属离子对黑斑蛙毒性影响研究进展。     

两栖类动物皮肤分泌物的相关研究

本研究主要探索两栖类动物皮肤分泌物不同的活体提取方法,从而进行优化。用乙醚和肾上腺素对非洲爪蟾、兰州地区的中国林蛙、中华大蟾蜍和花背蟾蜍进行刺激,收集其皮肤表面分泌物,分别对培养的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌及红色毛廯菌进行抑菌性观察。结果显示:用乙醚方法刺激两栖类动物获得的分泌物量较多,同时非洲爪蟾皮肤分泌物产量较其他物种多。非洲爪蟾及中国林蛙对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和红色毛廯菌抑菌效果较好。     

一种广谱、低毒的抗菌肽类似物HJH-3的生物学活性和膜活性的测定

为了解牛红细胞抗菌肽(AMPs) P3的类似物HJH-3的活性、稳定性及潜在的作用机制,本研究采用微量倍比稀释法测定AMPs HJH-3对试验菌株的最小抑菌浓度(MIC);同时测定该AMPs对红细胞的溶血性;采用双层琼脂扩散法检测了HJH-3的稳定性;通过荧光探针-酶标仪分析技术和电镜技术检测了HJH-3潜在的膜作用机制。结果显示,HJH-3对与感染相关的不同细菌均具有广泛的抗菌活性,其在大于5 MIC时对红细胞的溶血作用比较低;HJH-3在耐受温度、酸碱度和离子强度等方面均具有很好的稳定性;在AMPs HJH-3的作用下,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜可以迅速去极化;电镜观察显示,HJH-3能够穿透大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜,并在其膜上形成孔洞,直接破坏了细胞的完整性,最终导致细菌的死亡。本研究证实了AMPs类似物HJH-3具有广谱的抗菌活性,其抗菌活性的发挥是通过改变正常细胞的跨膜电位和破坏细菌膜的完整性来实现的。本研究为AMPs HJH-3的开发应用奠定了实验基础。     

枯草芽孢杆菌B43对香蕉枯萎病菌抑菌活性及其活性成分分析

为明确拮抗菌枯草芽孢杆菌B43菌株拮抗香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 4,FOC-4)的能力及其抑菌活性物质的性质,本研究采用平板对峙法进行抑菌谱试验;酸沉淀、有机溶剂萃取法提取B43菌株中的抑菌活性物质并作稳定性测定;根据脂肽类抗生素合成相关基因序列对B43基因组进行PCR扩增检测,运用LC-MS对粗提物作成分分析。结果表明,B43菌株对21种植物病原真菌均有较好的抑菌活性;酸沉淀法粗提物具有较好的耐热及耐紫外线特性,但不耐强酸强碱;通过特异性引物PCR检测,B43菌株基因组中含有srfAB、ituA、ituB、ituD、fenD、yndJ、sfp、mycB、lpa-14或fenB等脂肽类合成相关基因;LC-MS分析发现粗提物中含有Surfactin、Iturin、Mycosubtilin、Bacillomycin和Fengycin 5类脂肽类抗生素的同系物24种。枯草芽孢杆菌B43菌株抑菌谱广,其发酵液酸沉淀粗提物对FOC-4具有良好的抑菌活性以及较好的稳定性,本研究不仅检测推断出粗提物中含有多种脂肽类抗生素及其同系物,且于菌株基因组中扩增出多种脂肽抗生素基因,说明该菌株可能能够产生多种脂肽类抗生素。B43菌株与已报道的多数拮抗FOC-4的芽孢杆菌菌株相比,效果好、活性物质种类更多,因此具有良好的生物农药开发应用前景。     

新牛蛙活性肽Catesbeianin-1a的抗菌抗肿瘤作用

通过筛选牛蛙皮肤cDNA文库得到具有较强抗菌抗肿瘤活性肽Catesbeianin-1a,合成其成熟肽氨基酸序列,MIC法测定抑菌活性结果表明,Catesbeianin-1a对临床常见的致病菌具有较强的抑菌活性,其中对猪链球菌2型的MIC为2.5mg/L,且对兔红细胞几乎无溶血性。MTT法测定多肽抗肿瘤细胞活性,结果 Catesbeianin-1a对胃癌细胞和肝癌细胞的抑杀活性很强,对肝癌细胞SGC7901的IC50为0.845mg/L。制作透射电镜超薄切片,利用透射电镜观察活性肽对细菌和肿瘤细胞超微结构的影响,旨在初步探讨牛蛙皮肤活性肽Catesbeianin-1a抗菌、抗肿瘤的作用机制,并以Catesbeianin-1a为基础进行分子改造来提高其抗肿瘤的靶向性并降低其毒性。     

不同种类浒苔多糖的体外抗菌活性研究

为研究浒苔多糖粗提物、浒苔多糖硒的抑菌活性,本试验以硫酸黏杆菌素、林可霉素、黄芪多糖和酵母细胞壁多糖为对照品,采用药敏试验检测浒苔多糖粗提物、浒苔多糖硒对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果表明:10～100 mg/mL浓度的浒苔多糖粗提物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未产生抑菌作用,浓度为20、50、100 mg/mL的浒苔多糖硒对金黄色葡萄球菌的抑菌圈和抑菌活性分别为6 mm(-)、8 mm(+)、18 mm(++),对大肠杆菌、沙门氏菌未产生抑菌作用。     

牛蛙(Rana catesbeiana)蛙皮抗菌肽基因的克隆、测序及其表达

利用RT—PCR的方法从牛蛙皮肤组织中克隆到大小为270bp的片段RCABP，将其克隆到pGEM—T载体，测序获得1个新的碱基序列。将此基因克隆到原核表达载体pQE一80L，获得融合表达质粒pQE一80L／DHFR／ABP，在1％IPTG诱导下进行表达。SDS—PAGE检测表明，重组蛙皮抗菌肽蛋白的表达量占菌体总蛋白的24％，以包涵体形式存在。体外抑菌试验表明，所构建的质粒能在大肠杆菌中表达具有体外抑菌活性的蛙皮抗菌肽，该融合蛋白具有良好的应用前景。     

圆孢芽孢杆菌A95抗菌蛋白的分离纯化及性质研究

对圆孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)A95产生的抗菌蛋白进行了分离纯化,并研究了其部分性质。菌株摇瓶发酵液离心后的上清液经硫酸铵40%~60%分级盐析获得粗提物。粗提物溶液经Sephadex G-100柱层析、DEAE-Sepharose Fast F low离子交换层析、Sephadex G-50脱盐纯化获得的抗菌蛋白,通过性质检测、电泳及MALDL-TOF-MS质谱检测,表明为分子量1.464~1.529 kD的一组环肽类抗菌蛋白。该抗菌蛋白对多种家蚕病原真菌具有较好的抗菌活性,参照美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)提出的标准,用微量液基稀释法分别测定了对绿僵菌、白僵菌和黄曲霉的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)。该抗菌蛋白对热稳定,对胰蛋白酶、蛋白酶K、氯仿有一定的耐受性,对酸部分敏感,对碱稳定。