小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P15基因的克隆和表达

通过PCR扩增出小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P15基因片段。将该片段连接到克隆质粒裁体pUC19的BamH Ⅰ酶切位点上，并对其序列进行了测定。结果表明，该基因长度为479bp，编码的表面蛋白由148个氨基酸残基组成。再将P15蛋白基因片段分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达，经SDS-PAGE分析和Western blot检测，结果表明，小球隐孢子虫P15蛋白基因在大肠杆菌内获得表达的融合蛋白相对分子质量为50000；在哺乳动物细胞中，重组痘病毒表达的蛋白相对分子质量为18000-22000，与直接从自然感染牛小球隐孢子虫分离的P15蛋白的相对分子质量相似。     

小球隐孢子虫子孢子表面蛋白CP15/60基因的克隆和序列分析

将小球隐孢子虫子孢子表面蛋白（CP15／60）编码区基因克隆及测序，并对其抗原决定簇进行分析。抽提牛源小球隐孢子虫孵囊基因组DNA，用聚合酶链反应（PCR）扩增编码CP15／60的基因，然后将其克隆到p MD18-T载体中，用双脱氧链末端终止法测DNA序列。结果，用PCR扩增获得了CP15／60的编码区基因，并测定了该基因编码区序列。与GebBank比较，核苷酸序列同源性为：98．9％；推导出的氨基酸序列同源性为：99．3％。     

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体基因的克隆和核苷酸序列分析

应用RT－PCR技术，从分泌具有抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞3D6中扩增出抗体VH和VL基因，用linker(Gly4Ser)3基因，将VH和VL基因连接成ScFv基因，并将其克隆至pMD-18T载体中。经核苷酸序列分析证实，VH、VL基因和linker基因拼接正确，基因全长为720bp。经计算机分析，VH和VL基因均为新发现的基因序列，符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链κⅢ家族。     

微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因的克隆及核苷酸序列分析

目的对编码微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)子孢子表面抗原CP15基因进行克隆和序列分析,并对其编码的氨基酸变异情况进行分析。方法对田间分离的鼠、兔、猪源微小隐孢子虫提取总RNA,经RT-PCR扩增CP15基因,克隆到pMD 18-T载体中,鉴定正确后进行序列测定,并与GenBank上下载的序列进行同源性比对。结果克隆的CP15基因核苷酸序列与GenBank登录的核苷酸序列比较,鼠源微小隐孢子虫同源性为99.23%,兔源微小隐孢子虫为97.96%,猪源微小隐孢子虫为98.72%,氨基酸序列同源性分别为100%、97.7%和98.4%。结论获得微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因,不同宿主来源的CP15基因序列高度一致,为利用该基因进行免疫预防和诊断研究奠定了基础。     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区。通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-4中含有轮状病毒的VP4基因片段。经核苷酸序列分析，表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区。     

四种隐孢子虫半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因的克隆和序列分析

为克隆不同种隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)的半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因,分析其核苷酸与编码氨基酸序列的变异情况,根据GenBank上公布的微小隐孢子虫(C.parvum)Cryptopain-1基因序列设计合成引物,用PCR技术从不同种隐孢子虫基因组DNA中扩增Cryptopain-1基因,并将其克隆至pZeroBack/blunt载体,阳性克隆经PCR鉴定正确后测序,与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因进行序列同源性比对,并进行系统进化分析。结果显示,本研究成功从泰泽隐孢子虫(C.tyzzeri)、火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、兔隐孢子虫(C.cuniculus)基因组DNA中扩增出Cryptopain-1基因。与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因比较,泰泽隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、兔隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸序列相似性分别为98.67%、94.53%、98.34%,演绎的氨基酸序列相似性分别为99.00%、96.51%、99.00%。研究结果为利用Cryptopain-1基因进行隐孢子虫的代谢、致病机理等研究奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析

用内切酶ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切大肠杆菌质粒ｐＥＷＤ２９９，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，最后将ｐＵＣ１８ＤＮＡ与５０５ｂｐ的ＬＴＢＤＮＡ进行连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＳａｃⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１。再将ｐＸＬＴ１进行ＥｃｏＲⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠＫｌｅｎｏｗ大片段补平、ＨｉｎｄⅢ酶切处理，然后与用ＨｉｃⅡ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＸｂａⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１－１。将质粒ｐＸＬＴ１－１进行核苷酸序列分析，确定了插入的ＬＴＢ基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列     

安氏隐孢子虫ITS-1序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内三株安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)即GD株、HN株和AH株的rDNA的内转录间隔区Ⅰ(ITS_1)序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在确定ITS_1是否可作为C.andersoni分子分类的遗传标记。结果表明:GD株、HN株和AH株的ITS_1序列基本一致,仅AH株有三个碱基的差异;但与GenBank注册的C.muris和C.parvum存在种间差异,而且差异显著。说明ITS_1可作为C.andersoni种的遗传标记,从而为隐孢子虫属的种间鉴定以及进一步的分子流行病学调查和分子诊断学研究奠定了基础。     

隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较

为克隆隐孢子虫不同基因型子孢子表面抗原P23基因,比较其序列差异,提取上海地区分离的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype)、隐孢子虫兔基因型(Cryptosporidiumrabbit geno-type)、隐孢子虫猪基因型Ⅱ(Cryptosporidiumpig genotypeⅡ)总RNA,经RT-PCR扩增P23基因,克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,并与GenBank上下载的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)序列进行同源性比对。结果显示,从隐孢子虫3个基因型中均扩增出了P23基因。与微小隐孢子虫P23基因核苷酸序列比较,隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型ⅡP23基因同源性分别为97.6%、97.3%、97.3%,氨基酸序列同源性分别为97.3%、97.3%和96.4%。获得了隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型Ⅱ子孢子表面抗原P23基因。     

大肠杆菌肠毒素ST1b基因的亚克隆及其核苷酸序列分析

以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。     

牛微小隐孢子虫表面抗原CP15基因原核表达及其表达产物的鉴定

试验旨在构建微小隐孢子虫表面抗原CP15基因原核表达载体并获得重组CP15蛋白。试验以已知重组质粒pMD-CP15为模板,PCR方法扩增出CP15基因片段,并亚克隆到pGEX4T-3,构建了在E.coli BL21中GST融合表达载体pGEX-CP15;经1 mmol/L IPTG进行诱导表达获得目的蛋白,其大小采用SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定。结果表明,扩增出约390 bp的微小隐孢子虫表面抗原CP15基因片段并成功构建pGEX-CP15质粒,表达出分子质量为42 ku的融合蛋白,与推导的理论值相符。Western blotting显示该蛋白能被GST血清识别。牛微小隐孢子虫表面抗原CP15基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及抗血清的制备

以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达载体,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明,获得了CP15-P23-CP15/60融合基因,并在大肠埃希菌中高效表达,Western blot显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清识别,制备的多克隆抗体能被重组蛋白特异性识别,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。     

微小隐孢子虫E2F样结构域包含转录因子CpELD基因的原核和真核表达

为了实现微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)E2F样结构域包含转录因子编码基因cpeld的原核和真核表达,设计2对特异性引物,以C.parvum卵囊cDNA为模板,PCR扩增得到cpeld基因,将其分别插入pET32a和p3XFLAG-CMV14载体.同时设计引物,扩增微小隐孢子虫类钙调蛋白(C...     

微小隐孢子虫类钙调蛋白基因的克隆与原核表达

为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。     

四川草科IL-15 cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank上登录的鸡白介素15（IL-15）基因序列,设计合成一对特异性引物,以ConA诱导的鸡脾淋巴细胞提取的总RNA为模板进行RT—PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体测序。测序结果表明,四川草科鸡IL-15开放阅读框（ORF）由564个核苷酸组成,编码187个氨基酸,与GenBank中公布的鸡白介素15基因进行比较,核苷酸和氨基酸同源性为98．6％-99．5％。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有亲水性,有很强的抗原性,共有3个潜在的N-糖基化位点,可能存在3个蛋白激酶C磷酸化位点,存在2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。     

微小隐孢子虫端粒序列及端粒酶活性的研究

为了探讨我国微小隐孢子虫(C.parvum)的端粒序列,试验根据国外已报道的端粒重复序列5’-CCTAAA-3’设计寡聚核苷酸探针(CCTAAA)5,并用地高辛标记,C.parvum基因组DNA经Bal31-HindⅢ酶切后进行Southern印迹杂交鉴定;并在此基础上,采用改进的端粒重复序列扩增(TRAP)法首次对子孢子和卵囊时期C.parvum的端粒酶活性进行检测。结果表明:C.parvum基因组DNA与探针(CCTAAA)5杂交,获得了较好的杂交条带,随着Bal31-HindⅢ酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱,说明C.parvum端粒序列定位在染色体的末端,与国外报道的C.parvum端粒序列一致,为5’-CCTAAA-3’;检测C.parvum端粒酶活性时发现,子孢子时期端粒酶具有活性,卵囊中未检测到端粒酶活性。