牦牛铜锌超氧化物歧化酶基因cDNA克隆测序及其分子进化研究

对牦牛Cu／Zn—SODcDNA进行克隆测序。所扩增片段长度为842bp,编码区长度为459bp。扩增片段与奶牛Cu／Zn-SODcDNA序列比较发现有16个碱基存在差异。通过与已知Cu／Zn-SODcDNA序列的7个物种：人、猪、鼠、大鼠、奶牛以及马的cDNA序列的比较构建了分子进化系统树。对所得序列的ORF分析发现,牦牛Cu／Zn—SOD由152个氨基酸组成,并对氨基酸序列进行了比对分析。     

牦牛血液铜锌超氧化物歧化酶cDNA克隆测序

本试验从牦牛血液中提取总RNA,然后用AMV反转录酶对其进行反转录产生第一条cDNA链。根据奶牛Cu/Zn-SODcDNA序列（序列号：NM174615）设计一对PCR引物,对反转录后产生的第一条cDNA链进行PCR扩增,并克隆测序,测序结果为483bp。结果证实可从牦牛血液中提取到少量合成的铜锌超氧化物歧化酶的mRNA。     

牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析.从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200 bp～1 000 bp之间.随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率.结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量.本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因.     

鸡β-防御素CDNA的克隆与序列分析

使用总RNA提取试剂盒,从1月龄粤黄鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-2)cDNA片段.PCR产物经凝胶回收纯化,加A尾后与载体pGEM-T Easy相连,然后转化感受态细胞DH-5α在含X-gal、IPTG的LA平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与提取质粒作限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序.结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为195bp,用Blast程序进行检索比较表明此扩增序列与Genbank中发表的鸡Gal-2 cDNA编码区序列100%相同.该cDNA编码64个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由36个氨基酸残基组成.     

鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。     

海兰褐鸡法氏囊中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及NOS cDNA克隆及序列分析

通过对海兰褐鸡法氏囊中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及iNOS cDNA克隆及序列分析,了解海兰褐鸡法氏囊中主要氧化-抗氧化酶的分布及其基因组成,为研究传染性法氏囊病及与法氏囊相关禽病的氧化-抗氧化发病机制奠定基础.结果显示,Cu/Zn-SOD、Mn-SODcDNA序列分别出现2个碱基的突变,iNOS cDNA序列与原始序列同源性为100％.海兰褐鸡法氏囊中存在Cu/Zn-SOD、Mn-SOD及iNOS 3种与氧化-抗氧化相关酶,并且Cu/Zn-SOD、Mn-SOD cDNA序列具有新特征,iNOS在海兰褐鸡体内是稳定存在的;海兰褐鸡可能与康奈尔K系鸡具有相似的遗传背景.     

牦牛低氧诱导因子-1α基因克隆及蛋白质结构分析

试验采用RT-PCR方法,以麦洼牦牛脾脏cDNA为模板扩增牦牛低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因,并运用生物信息学软件对其序列进行分析。结果发现,扩增得到的麦洼牦牛HIF-1α基因编码区长为2 472 bp,编码823个氨基酸;蛋白质预测结果显示,该蛋白质分子质量为92.13 ku,等电点5.09,为亲水性蛋白,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,有69个磷酸化位点和4个N-糖基化位点;系统进化树显示,麦洼牦牛与牦牛、野牦牛、普通牛亲缘关系最近。本试验成功克隆麦洼牦牛HIF-1α基因并对其序列进行了分析,为进一步研究HIF-1α基因的功能提供参考。     

蒙古绵羊卵丘细胞ghrelin部分序列的鉴定

为了研究生长激素释放多肽(ghrelin)mRNA是否在蒙古绵羊卵丘细胞中表达,试验根据Gen-Bank中报道的绵羊ghrelin序列设计1对特异性引物,以蒙古绵羊卵丘细胞中的RNA为模板,采用实时定量RT-PCR技术扩增蒙古绵羊ghrelin的cDNA,并进行测序分析。结果表明:扩增得到的蒙古绵羊ghrelin cDNA为ghrelin的部分序列,将测序结果与已发表的绵羊ghrelin序列进行比对发现,233个碱基中有1个碱基的差异,该差异不影响翻译后多肽的序列;该cDNA片段包含长度为231 bp的开放读码框(ORF),编码77个氨基酸的绵羊ghrelin前原肽。     

野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆分析与原核表达

超氧化物歧化酶是野桑蚕保护酶体系的重要酶类。利用RT-PCR方法克隆出野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)cDNA(EMB I登陆号:AM410997),其开放阅读框ORF长465 bp,编码154个氨基酸。同源性及系统进化分析表明,推导出的氨基酸序列与3种果蝇的同源性平均为69.3%,与线虫为57%,各物种中与Cu/Zn结合的残基高度保守。利用ExPASy的ScanProsite以及PSort和TMpred对此编码的蛋白质结构和功能域分析,预测出其具有2段Cu/Zn-SOD特异序列,且该蛋白不存在信号肽以及跨膜区。将Cu/Zn-SOD cDNA克隆到pET-28 a(+)表达载体,测序鉴定后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定其表达的融合蛋白质分子量为19.4 kD。     

甘南牦牛Lfcin基因克隆及序列分析

利用PCR技术从甘南牦牛基因组DNA中扩增获得了含乳铁蛋白素（lactoferricin,Lfcin）基因的DNA序列,将该DNA序列连接于pGEM-Teasy载体并测序,将甘南牦牛含Lfcin基因的DNA序列与奶牛相应序列进行比对,同时对牦牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。结果：试验首次克隆获得了含甘南牦牛乳铁蛋白（lactoferrin,LF）第二外显子的DNA序列（在Gen-Bank中获得登陆号EU247256）,共778 bp,其中LF基因第二外显子长165 bp,编码55个氨基酸,Lf-cin蛋白占25个氨基酸;序列分析结果显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛相应序列存在3个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同;各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性,Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律。     

牛血Cu/Zn-SOD提取条件的研究

本研究以牛血为试验材料,研究了Cu²+浓度、Zn²+浓度、热变性温度和热变性时间4种单因素分别对牛血中Cu/Zn-SOD活性的影响。以4种单因素为基础设计了4因素5水平正交试验,通过邻苯三酚法测定了酶活性,考马斯亮蓝法测定了蛋白含量,聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了蛋白纯度,确定了牛血Cu/Zn-SOD的最佳提取条件。结果表明：当Cu²+、Zn²+分别为6和12 mmol/L条件下,90 ℃热变性35 min,可得到较高活性和比活力的Cu/Zn-SOD。本研究意在为更简便、经济的牛血中Cu/Zn-SOD提纯方法提供参考。     

犬布氏杆菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为检测犬布氏杆菌(Brucella canis)重组Cu/Zn-SOD蛋白的抗原性,本研究通过PCR方法扩增B.canis的Cu/Zn-SOD基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-SOD.将该质粒转化受体菌E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析,...     

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

摘要：根据已报道的多种植物Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物,以油茶（Camellia oleifera）叶片总RNA为模板,通过RT PCR分别扩增得到一个375 bp的Cu/Zn SOD基因片段和一个429 bp的Mn/Fe SOD基因片段。将片段序列在NCBI网站上进行同源性比对,表明本研究克隆的结果均与多种植物的Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因存在亲缘关系,因而认为所克隆的基因片段就是油茶SOD基因;并运用DNAStar5.0软件分别进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为125个残基和143个残基;具有所有植物SOD基因共有的保守区域;与多种植物Cu/Zn SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在80%和84%以上,与其他植物的Mn/Fe SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。     

新西兰娟珊奶牛、荷斯坦奶牛与中国荷斯坦奶牛抗氧化指标比较

在相同的饲养管理条件下,在冬、夏两季随机抽取3种牛的血液样品,使用可见光分光光度法、原子吸收与荧光分光光度法,分别对3种牛的抗氧化指标T-SOD、Cu/Zn-SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA以及血清微量元素Se、Cu、Zn、Mn进行系统测定与分析。试验结果表明:冬季,引进娟珊奶牛和荷斯坦奶牛的T-SOD、Cu/Zn-SOD、T-AOC、Cu、Zn、Mn均高于中国本地荷斯坦奶牛,差异显著(P<0.05),GSH-Px与本地荷斯坦奶牛比较差异不显著(P>0.05);夏季,引进娟珊奶牛、荷斯坦奶牛、本地荷斯坦奶牛的T-SOD、Cu/Zn-SOD、GSH-Px、Mn、Se差异不显著(P>0.05)。引进娟珊奶牛的T-AOC显著高于荷斯坦奶牛,差异显著(P<0.05);从对相同季节的分析可知,夏季引进娟珊奶牛,其适应性有一定的提高。     

毕赤酵母表达铜锌超氧化物歧化酶中试工艺研究

正交设计优化铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母在摇瓶及30L发酵罐的诱导表达条件,用两步层析法纯化表达的目的蛋白,在不同温度下进行原液稳定性试验。用考马斯亮蓝检测蛋白含量,活性检测试剂盒检测目的蛋白活性。纯化后原液参照中华人民共和国药典三部2005版进行检测,用SDS-PAGE、HPLC检测纯度,免疫印迹法检测rhCu,Zn-SOD特异性,等点聚焦测定该酶等电点,地高辛法检测残余DNA含量,酶联免疫法测定残余蛋白含量。结果显示正交试验的大罐高密度发酵最适条件比摇瓶的最适条所获得的目的蛋白活性高8倍,纯化后,HPLC纯度为99.7%,原液比活性大于6.0×103 U/mg,各项检测指标达到生物制品检定标准。该酶在45、65、85、100℃的半衰期分别为240、120、30、15。具有良好的酶稳定性。本研究建立了发酵、纯化的中试工艺,获得高表达、高纯度及高比活的铜锌超氧化物歧化酶,为规模化生产奠定了基础。     

娟姗牛改良牦牛效果浅析

本文测定了娟姗牛改良牦牛的效果,分析了牦牛改良繁活率低的原因,提出了牦牛乳用改良的措施。     

Antioxidant capacity and concentration of redox-active trace mineral in fully weaned intra-uterine growth retardation piglets

Background: The redox status of intra-uterine growth retardation(IUGR) piglets post-weaning has been poorly studied.Methods: Newborns from twenty-four sows were weighted, weaned at 21 d and fed a starter diet until sampling.Sampling was done at 14 d post-weaning. A piglet was defined as IUGR when its birth weight was 2 SD below the mean birth weight of the total population. At weaning, eighteen piglets with nearly equal body weight from each category(i.e. IUGR or normal birth weight(NBW) piglets) were selected and then allocated to two treatments,consisted of six replicates with each pen having three piglets.Results: Compared with NBW group, IUGR significantly decreased average daily gain(P 0.001), average daily feed intake(P = 0.003), and feed efficiency(P 0.001) of piglets during the first two weeks post-weaning. IUGR decreased the activities of total antioxidant capacity(P = 0.019), total superoxide dismutase(T-SOD, P = 0.023),and ceruloplasmin(P = 0.044) but increased the levels of malondialdehyde(P = 0.040) and protein carbonyl(P = 0.010) in plasma. Similarly, the decreased activities of T-SOD(P = 0.005), copper- and zinc-containing superoxide dismutase(Cu/Zn-SOD, P = 0.002), and catalase(P = 0.049) was observed in the liver of IUGR piglets than these of NBW piglets. IUGR decreased hepatic Cu/Zn-SOD activity(P = 0.023) per unit of Cu/Zn-SOD protein in piglets when compared with NBW piglets. In addition, IUGR piglets exhibited the decreases in accumulation of copper in both plasma(P = 0.001) and liver(P = 0.014), as well as the concentrations of iron(P = 0.002) and zinc(P = 0.048) in liver. Compared with NBW, IUGR down-regulated m RNA expression of Cu/Zn-SOD(P = 0.021) in the liver of piglets.Conclusions: The results indicated that IUGR impaired antioxidant capacity and resulted in oxidative damage in fully weaned piglets, which might be associated with the decreased levels of redox-active trace minerals. This study highlights the importance of redox status in IUGR offspring and provides a rationale for alleviating oxidative damage by dietary interventions aiming to supplement trace minerals and to restore redox balance in the future.