食品中产单核细胞李斯特菌PCR检测方法的建立

根据产单核细胞李斯特菌hlyA基因设计引物,进行PCR扩增,检测该方法的特异性和灵敏度。人工污染样品经Half-fraser和Fraser增菌后进行PCR检测。结果表明,产单核细胞李斯特菌扩增出234bp的条带,对照菌未扩增出目的条带。该方法的灵敏度为104cfu/mL。人工污染样品的检出限为8cfu/25g,说明PCR方法检测食品中产单核细胞李斯特菌具有快速、特异、敏感等特点,具有较高的实用价值。     

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。     

动物粪便沙门菌PCR检测技术的研究

为了建立一种动物粪便样品中快速、特异、敏感的沙门菌检测方法,根据沙门菌肠毒素stn基因设计一对引物,对不同血清型的沙门菌和非沙门菌进行PCR检测,并对该PCR方法进行反应的灵敏度、模拟粪便样品的最低检出限测定及粪便样品的检测。运用该方法对250份粪便样品进行检测,同时用传统方法进行验证。结果表明,设计的引物特异性好,能专一性扩增出约260 bp条带;该引物灵敏度高,能进行有效检测的核酸最低起始量为43.85 pg,纯菌检测灵敏度达1 cfu/mL。接种沙门菌到粪便样品中,当粪便样本中菌量达103cfu/mL以上时,不需要增菌,沙门菌可立即检出,增菌后检出限可以达到1 cfu/mL。PCR检测250份样品共检出18份阳性,同时传统细菌培养方法证明结果正确。该方法可用于粪便样品的检测。     

Percoll分离法与多重PCR快速检测肉品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌

为从食品中有效分离致病菌,去除PCR反应的抑制因子,提高多重PCR检测灵敏度,本研究利用Percoll密度梯度离心的前处理法从鲜肉样品中高效分离沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌,以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和志贺氏菌ipaH基因为靶基因,经过PCR分别扩增出255 bp、506 bp、620 bp的DNA片段,DNA测序证实这些片段为目的扩增产物。该体系检测猪肉匀浆液中3种致病菌的灵敏度为6.2×103 cfu/mL、1.2×103 cfu/mL和2.4×103 cfu/mL,检测时间约6 h。Percoll前处理法与多重PCR检测肉中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌为同时检测肉类样品中多种致病菌提供了有效的检测方法。     

IMS-PCR对食品中单增李斯特菌快速检测

为了建立一种快速检测食品中单增李斯特菌的方法,试验设计了Listeriolysin O、23SrRNA和hly、iap四对引物分别做双重PCR引物,并与免疫磁珠法分离LMO相结合对LMO进行快速鉴定。结果显示,这四对引物分别扩增条带为700bp,240bp,308bp,505bp,可分辨不同种属的李斯特菌和其它不同菌株。建立的IMS-PCR方法最低检测限可达到1CFU/25g（mL）食品,通过检测食品样本188份,结果与常规检测方法所得的结果一致率为100%。所以,建立的IMS-PCR方法具有极好的特异性、敏感性和稳定性,在24h内可得到准确的检测结果,具有广阔的发展和市场应用前景。     

针对单增李斯特菌iap基因PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。     

基于tlh和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法

为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

志贺氏菌检测和分群实时荧光PCR方法的建立

为对志贺氏菌属细菌进行快速、准确检测和分群鉴定,根据志贺氏菌invC、rfc、wbgZ和rfpB基因,分别设计引物和探针,建立了鉴定志贺氏菌属以及福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺菌氏菌实时荧光PCR方法,同时将根据ompA基因设计的引物和探针作为内参照,并通过特异性试验和人工接种试验等对该方法进行验证。结果显示,该方法对17株志贺氏菌和19株非志贺氏菌均出现100%的特异性;用增菌肉汤直接进行PCR检测,发现在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中的志贺氏菌检出限为1～3 cfu/25 g(mL),在原奶、生肉和奶粉中的检出限分别为≤8 cfu/25 mL、12 cfu/25 g和≤12 cfu/25 g;分离培养后再对可疑菌落进行实时荧光PCR鉴定,发现所有样品的检出限为1～3 cfu/25 g(mL),与传统培养法检出限一致。结果表明,该实时荧光PCR方法是一个快速、敏感、特异的检测方法,适合于志贺氏菌的常规检测分析。     

鸡胚胎性病原茵多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏茵(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)4种导致鸡胚死亡病原菌的多重PCR方法,本研究根据B.aviun的ompA基因、Salmonella的invA基因、E.coli的phoA基因和P.aeruginosa的toxR基因序列,各设计一对特异性引物进行多重PCR反应,并对反应体系和条件进行优化.结果显示,4对引物分别扩增出597bp、724bp、372bp和278bp的目的条带;并且特异性强不与其他非目的茵发生反应.经优化B.aviun、P.aeruginosa和E.coli多重PCR检测灵敏度达到104cfu/mL,而Salmonella为103cfu/mL.本研究建立的多重PCR方法为相关病原茵的快速检测提供方法.     

单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×10~2拷贝/μL和10~3cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。     

大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种可以同时扩增大肠杆菌(E.coli)F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因保守序列的多重PCR检测方法,本研究设计合成5对分别针对F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的特异性引物,以具有相应菌毛基因的E.coli参考菌株DNA为模板,通过对多重PCR反应条件的优化,建立了检测F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR方法能够特异性扩增F4、F5、F6、F41、F18菌毛基因的目的片段,大小分别为770 bp、533 bp、422 bp、643 bp和1140 bp,该方法对沙门氏菌、猪丹毒杆菌、巴氏杆菌以及无菌毛基因的E.coli等参考菌株均无特异性扩增片段,检出F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的最低活菌浓度分别为5.3×10^5cfu/mL、3.7×10^6cfu/mL、3.1×10^5cfu/mL、3.7×10^7cfu/mL、6.9×10^5cfu/mL。用不同批次的引物和试剂进行3次多重PCR检测均能扩增出目的条带,表明建立的多重PCR方法有很好的批内和批间重复性。对90株大肠杆菌临床分离菌株菌毛基因进行检测,F4阳性率为3.33%,F5阳性率为2.22%,未检测到F6、F41和F18阳性菌株,其检测结果与常规单一PCR的检测结果一致。研究表明:建立的E.coli菌毛基因多重PCR分型方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,可用于E.coli分离菌株菌毛基因型的快速鉴定,同时提高了检测效率。     

Comparison of direct colony count methods and the MPN-method for quantitative detection of Listeria in model and field conditions]

In order to compare the plate count method for quantitating Listeria, as published in the "Official Collection of Testing Methods" in section 35 LMBG (L. 00.00-22), to an MPN-method for Listeria based on the same mediums, these two detection methods for Listeria were tested in three sets of experiments and a routine sample status evaluation. A pure broth culture of L. monocytogenes, artificially with L. monocytogenes contaminated ground meat, artificially contaminated and cold stored ground meat as well as 77 ground beef samples from Berlin retail food stores were used in the four trials. The detection limit of the MPN-method is about 66% lower than the plate count method allowing detection of a clearly greater number of Listeria-positive samples from naturally contaminated ground meat. The MPN-method yielded more Listeria spp.-positive samples (rel. 43%) and more L. monocytogenes-positive samples (rel. 21%) versus the colony count method based on the results from the field trial using ground beef samples from retail food stores in Berlin. Nevertheless the standardized colony count method is preferred over the MPN-method for routine use because of its slightly higher productivity and much smaller variation in the results. However, the MPN-method is preferable for epidemiological studies because of the significance of the lower detection level. The random sampling evaluation of ground beef from retail stores indicated that 39% of the samples were Listeria spp.-positive and 31% were L. monocytogenes-positive when using the colony count method. A total of 56% of the meat samples were found to be Listeria spp.-positive and 38% L. monocytogenes-positive when the MPN-method was used. Population levels ranged from 10 to 580 cfu/g (Listeria spp.-positive samples) and from 10 to 270 cfu/g (L. monocytogenes-positive samples) for the colony count method. The MPN-method yielded population levels of 3.6 to 930 MPN/g for Listeria spp.-positive samples and 3.6 to 150 MPN/g for L. monocytogenes-positive samples. L. monocytogenes strains isolated using the colony count method belonged to the following serovars: 1/2a (46%), 1/2b (13%), 1/2c (33%), 3b (4%) and 4c (4%). A similar serovar isolation pattern was found for L. monocytogenes-positive MPN-tubes. The most common serotype was 1/2a (43%), followed by 1/2c (32%) and 1/2b (14%). The serotypes 3c, 4b and 4c were all isolated 4% of the time.     

破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR检测灵敏度试验

蚕微粒子病检测技术是该病防治中的一项重要技术,本文在通过破碎法提高模板核酸获取量的基础上,对纯化家蚕微粒子虫孢子的PCR检测灵敏度进行了测试。提取核酸-模板稀释测试12对引物的灵敏度中有4对引物达到0．05粒（10^2粒/mL）、4对引物5粒（10^4粒/mL）、1对引物50粒（10^5粒/mL）、2对引物500粒（1...     

牛新孢子虫内标多重PCR检测方法的试验

本试验以牛新孢子虫NcSAG1基因、Nc-5基因和NcSRS2基因作为检测新孢子虫病的目的基因,以牛性腺(prolac-tin)基因作为内标对反应过程进行监测,对上述基因各设计1对引物。结果表明,4对引物可分别扩增出201bp、231bp、256bp和156bp的目的条带。经反应条件的优化,该方法具有较好的灵敏度,各质粒在103 copies/反应时,均可于同一管中扩增出较清晰的目的条带,只比单重PCR的灵敏度低了10倍,且不受内标模板存在的影响。经临床应用研究,该方法具有较好的特异性和重复性,可用来对新孢子虫进行快速准确的检测。     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立

为建立一种快速准确检测兔多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的PCR方法,本研究以P.multocida的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的P.multocida的16S rRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了P.multocida PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60 cfu/mL,采用该PCR方法扩增P.multocida标准株和分离株均能扩增出643 bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本实验所建立的P.multocida PCR检测方法快速、敏感、特异、可靠,可用于P.multocida的快速鉴定与诊断。同时用建立的PCR方法对临床疑似病兔的脏器分离菌进行扩增,可扩增出目的条带,与细菌的分离结果相一致。     

使用二重PCR方法快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

本研究以单核细胞增生性李斯特菌Hly基因和InlA基因作为靶序列设计2对引物,建立了检测单增李斯特菌的二重PCR方法。结果表明,该方法可以同时扩增出单增李斯特菌的Hly基因和InlA基因,而对大肠杆菌、沙门氏菌等食品中的常见致病菌和英诺克李斯特菌均不能扩增出任何条带,表现出良好的特异性。二重PCR方法的最低检测限为104CFU/mL,并能够用于鉴定实验小鼠攻毒后内脏器官的单增李斯特菌分离培养物。该方法表现出良好的特异性、敏感性和通用性,适用于单增李斯特菌的快速鉴别检测。     

Use of the bead beater for preparation of Mycobacterium paratuberculosis template DNA in milk.

Mycobacterium paratuberculosis is a recognized chronic enteric pathogen that can affect many different species of animals, including primates. It has been suggested that this organism is associated with Crohn's disease in humans, and that milk is a potential source of human exposure to this organism. The limit of the detection of M. paratuberculosis in milk samples by direct PCR was 10(5) cfu/mL if the traditional boiling method was used for template DNA preparation. In this study, an improved method for template DNA preparation was examined. The method involves the use of a bead beater, which breaks up bacterial cell wall mechanically by vibrating bacteria with microbeads at high speed. The effectiveness of this method for lysing M. paratuberculosis cells was compared to that of the freeze-thaw method, and use of commercial kits such as the InstaGene Matrix and the QIAamp Tissue Kit. The bead beater procedure was tested in combination with various cell lysis and template DNA preparation procedures to determine which of these steps improved the limit of detection of PCR assay that amplifies a 413 bp fragment of the IS900 gene. Results showed that the use of the bead beater, in combination with the use of lysis buffer, boiling, and isopropanol precipitation, decreased the limit of detection of M. paratuberculosis in milk by the PCR to 10(2) cfu/mL. The limit of detection was further decreased to 10 cfu/mL when 0.0037% bovine serum albumin was included in the PCR reaction mixtures. The improved assay was 10- to 10(4)-fold more sensitive than the PCR assays using template DNA prepared by other lysis procedures including boiling alone, freeze-thaw plus boiling, or use of commercial kits for lysis.     

应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp:该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10-7μg/mL,是单一PCR的103倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。