广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

【目的】监测2021年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的分子流行动态,为PRRSV综合防控措施的制定提供参考。【方法】在广东省内不同地区PRRSV检测为阳性的37个规模猪场采集521份患病猪组织样本进行PRRSV检测。对样本进行ORF5基因测序,采用DNAStar分析ORF5核苷酸的同源性及其推导氨基酸的同源性,并用Mega7.0构建基于ORF5基因的系统遗传进化树。【结果】从37个猪场采集的样品PRRSV阳性率为24.4%,猪场阳性率为45.9%。通过测序分析获得17株来自不同猪场的PRRSV ORF5基因序列,遗传进化分析表明所有毒株均属于北美毒株（PRRSV 2）,其中有5株属于Lineage 8(JXA1-like和CH-1a-like）谱系,9株属于Lineage 1(NADC30-like和NADC34-like）谱系,3株属于Lineage 3(QYYZ-like)谱系,没有监测到Lineage 5(VR2332-like)谱系的毒株。17株PRRSV毒株的...     

福建NADC30-like PRRSV FJLY01株的全基因组分子特征分析

【目的】了解福建省NADC30-like PRRSV FJLY01株的分子生物学特征和遗传演化规律,为PRRSV的防控提供参考。【方法】对采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,以NADC30PRRSV毒株基因序列为参考设计并合成9对引物,分别对分离株序列进行分段PCR扩增,经克隆测序后进行序列拼接,采用MEGA 6.0软件进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制其与其他35株毒株的系统遗传进化树。【结果】FJLY01株基因组全长为15 016bp(不包含polyA),包含10个开放阅读框,5′-UTR长190bp,3′-UTR长148bp,Nsp2基因缺失393bp。Nsp2蛋白存在类似PRRSV MN184和NADC30株的131个氨基酸的缺失。核苷酸比对结果表明,FJLY01株与VR-2332、MLV RespPRRS/Repro、CH-1a和BJ-4株核苷酸的同源性为85.2%~86.3%,与JXA1、HuN4等HP-PRRSV株核苷酸的同源性为83.7%~84.1%,与MN184A、MN184B株核苷酸的同源性为87.9%~88.2%,与NADC30株核苷酸的同源性最高,为97.1%。系统进化树分析表明,该毒株属于NADC30-like毒株,与JXA1、VR2332和CH-1a的亲缘关系较远。【结论】福建省存在NADC30-like毒株,应该加强PRRSV的监测。     

PRRSV JX0708株结构蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

根据GenBank中登录的美洲型PRRSV JXA1株基因组序列设计合成了4对引物,应用RT-PCR技术对PRRSV JX0708株结构蛋白基因进行扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行分析,并与国内外分离株进行核苷酸序列以及推导的氨基酸序列同源性比较.结果表明:PRRSV JX0708株结构蛋白基因长约3 186bp,分为ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个基因区;与国内分离的高致病性PRRSV美洲型毒株HuN、GD、JXA1、LN和普通毒株CH-1a以及经典毒株VR-2332和疫苗毒株pMLV的核苷酸及其推导的氨基酸同源性分别为88.0%～100.0%和83.5%～100.0%;而与欧洲型经典毒株LV和Euro-1的同源性差异显著,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为64.0%～69.7%和53.3%～79.9%.遗传进化分析表明,PRRSV JX0708株在基因型上属于美洲型,同时美洲型PRRSV的变异存在某种地域和时间跨度上的相关性,但每个结构蛋白基因的变异并不严格遵从这种规律,而有所差异.     

新疆NADC30-like PRRSV的分离鉴定及遗传变异分析

为了探明研究新疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NADC30-like病毒株XJTK的遗传变异特征,本试验分离病毒株后对该病毒的Nsp2和ORF5基因进行克隆和测序,其片段大小分别为648 bp和603 bp,其中Nsp2基因存在3处不连续共393个核苷酸的缺失,分别缺失333,57和3个核苷酸,完全符合NADC30-like毒株的基因特征;将病毒株XJTK与已知北美型PRRSV代表株VR2332,高致病性PRRSV国内代表株JXA1、TJ,美国分离株NADC30,及NADC30-like国内代表株HENAN-HEB、CHsx1401进行序列比对表明,XJTK株Nsp2和ORF5基因核苷酸序列与参考株同源率分别为36.4%～90.3%和83.7%～93.0%,进一步遗传进化分析表明,其与PRRSV毒株VR2332、JXA1和TJ株亲缘关系较远,与美国分离株NADC30及国内NADC30-like代表株CHsx1401和HENAN-HEB亲缘关系较近,同属于NADC30-like亚群,但仍属于相对独立的分支。本研究是新疆首次证实猪群中存在NADC30-like PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防制提供参考依据。     

欧洲型PRRSV的分离鉴定及其ORF5基因序列分析

采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,采用RT-PCR方法扩增PRRSV ORF5全基因并进行序列测定分析。从采集的病料中成功分离2株PRRSV,2株分离毒株ORF5与Gen Bank中选择的参考毒株比较发现,其核苷酸同源性为82.5%~90.6%,氨基酸同源性为80.6%~91.5%。通过序列进行系统进化分析均显示分离毒株属于欧洲型PRRSV,ORF5基因与LV相比变异较大,应加大对欧洲型PRRSV的监控。     

2010年云南PRRSV分离株ORF5基因的遗传变异分析

 为了了解云南猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的遗传变异情况及其与猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学关系,对2010年分离到的10个云南PRRSV流行毒株进行了ORF5基因序列的测定与分析。结果显示云南分离株与中国大陆首次分离株CH1a,北美代表株VR2332和欧洲型代表株LV之间的核苷酸同源性分别为93.2%-94.2%,87.4%-89.6%和62.5%-64.0%;氨基酸同源性为90.0-91.5%,87.1-88.6%和51.7-57.7%。遗传进化分析显示,云南10株分离株属于美洲型,并分为两个基因亚型。与传统毒株相比,云南分离株ORF5基因及其推导的氨基酸的变异主要以点突变为主,但关键氨基酸位点未见明显改变,表明目前云南省所流行的PRRSV仍以经典毒株为主。研究结果为云南猪繁殖与呼吸综合征的控制提供了依据。     

PRRSV新疆分离株的ORF5序列分析与同源性比较

采用RT-PCR技术,分别对PRRSV新疆分离株XJ-a,XJ-b,XJ-c的ORF5片段的ORF5基因进行扩增,获得长度为603 bp的特异性目片段.ORF5片段序列分析表明,新疆3个分离株的ORF5基因与欧洲型PRRSV毒株序列核苷酸的同源性为56.1%～56.4%,与标准美洲型PRRSV毒株序列的核苷酸同源性达到86.6%～87.2%,与国内部分省市流行株的同源性在96.0%～99.2%.PRRSV新疆分离株属于北美洲型PRRSV的变异毒株,属同一亚型,毒株间也存在一定的差异,具有高度致病性的生物学特征.     

2014—2016 年广东省PRRSV GP5 基因遗传变异分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,采集了2014—2016年间广东地区46个猪场317份疑患PRRS的临床样品进行检测,并对阳性样品的GP5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,选出21株PRRSV GP5基因进行序列比对和遗传进化分析。结果表明:所分离的PRRSV均属于美洲株,21株PRRSV GP5基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为82.4%~98.7%和78.6%~98.5%,其中2株与美国NADC30分离株同属亚群Ⅲ,10株与近几年广东省内分离的PRRSV毒株QYYZ和GM2同属于亚群Ⅳ。PRRSV GP5基因的遗传进化分析结果表明,亚群Ⅲ和亚群Ⅳ是近几年在广东省内流行的新兴亚群,研究结果将为PRRSV疫苗的选择以及防控方案的制定提供参考。     

辽宁地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

为研究辽宁地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的生物学特性及遗传变异情况,通过RT-PCR方法对PRRSV阳性样品的ORF5基因进行扩增,应用DNA Star软件对检测的序列进行比对和遗传变异分析。结果显示,分离的8株PRRSV的ORF5基因全长为603 bp,均属北美型,不同分离株间的核苷酸、氨基酸同源性分别为91.5%~99.0%、88.1%~98.5%;遗传变异分析表明,分离株处于不同的进化分支,但均属于亚群3,为高致病性PRRSV。以上结果表明,辽宁地区主要流行毒株为高致病性PRRSV,在不同地区有不同的PRRSV毒株同时流行,但具有相同的进化来源。     

河南地区NADC30-like PRRSV毒株的增殖特性与遗传进化分析

为研究河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特点和遗传变异情况,采集河南省滑县地区猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场中的病料,经研磨、稀释、离心处理后将悬液上清接种于原代猪肺泡巨噬细胞,进行病毒分离培养,结果显示,PAM出现典型细胞病变效应,将得到的分离株命名为HNhx。应用PRRSV N蛋白的特异抗体进行间接免疫荧光(IFA)试验,结果表明,接种HNhx分离株的PAM出现特异性荧光,证明该分离株为PRRSV。应用RT-PCR技术对Nsp2区进行扩增分析,根据扩增目的产物大小推测HNhx分离株为NADC30-like毒株。遗传分析发现,与其他参考毒株相比,HNhx毒株的ORF3、ORF4和ORF5基因与NADC30毒株的同源性最高。基于ORF3、ORF4和ORF5序列构建进化树,系统进化分析的结果表明,HNhx归于NADC30-like亚群。     

2007－2009年部分猪群PRRSV ORF5和Nsp2基因的克隆与序列分析

【目的】了解2007-2009年部分猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株的遗传演化规律。【方法】按常规方法,从2007-2009年收集的疑似蓝耳病猪群组织样品中分离PRRSV,应用RT-PCR方法,对分离的10株PRRSV的ORF5和Nsp2基因进行扩增,测序后与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2基因进行核苷酸、氨基酸序列比较及遗传进化分析。【结果】分离到的SDWF5、SDCX1、LN3、LN8、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB1、ZB2共10株PRRSV均属于美洲型PRRSV变异株,其ORF5基因全长均为603bp,编码约200个氨基酸,其推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;SDWF5、SDCX1、LN3、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB2等8个分离株的Nsp2基因全长为2845bp,编码950个氨基酸,与代表毒株VR-2332相比,8个分离株在Nsp2基因推导氨基酸序列的480和532～560位发生了不连续的30个氨基酸缺失。与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2序列进行比较后发现,10个分离株的ORF5、Nsp2基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列均发生了较大变异。遗传进化分析发现,10个分离株与以CH-1a为代表的国内流行毒株处于同一分支,与JXA1等变异毒株的遗传距离较近。【结论】来源于不同猪群的10个PRRSV分离株的遗传关系存在交叉,没有明显的地域特征,但可能具有相同的始祖Ch-1a。     

猪场环境中苍蝇携带的PRRSV NSP2及ORF5基因遗传特征差异性分析

为了解猪场环境中苍蝇携带的PRRSV的遗传特征,初步评估昆虫媒介传播PRRSV的潜在风险。从已证实感染PRRSV的猪场收集苍蝇和感染猪的淋巴结,分别提取RNA后采用RT-PCR扩增PRRSV的NSP2和ORF5基因,结合DNASTAR等生物学软件将其测序后的序列与其他PRRSV代表株的NSP2和ORF5基因进行生物信息学分析。结果表明:苍蝇源PRRSV NSP2基因与该猪场猪源及其他PRRSV代表株的NSP2基因核苷酸同源性为45.9%～95.9%,氨基酸同源性为33%～92.9%;ORF5基因核苷酸的同源性为61.5%～95.2%,氨基酸的同源性为32.5%～90.9%。进一步的序列分析结果显示苍蝇源与猪场猪源以及PRRSV代表株的NSP2和ORF5基因之间存在多个氨基酸位点的替换和缺失。进化树结果表明苍蝇源和该猪场猪源PRRSV的NSP2和ORF5基因均在同一分支,属于美洲型毒株,但二者分别与PRRSV GD株和NVDC株同源关系最近。综上表明,苍蝇源和该猪场猪源以及PRRSV代表株的NSP2和ORF5基因存在不同程度的差异,这些差异是否会影响PRRSV生物学特性需要后续进一步研究...     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及ORF5基因序列与国内外毒株的分析和比较

分析一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) ORF5基因遗传变异情况及与国内外其他毒株比较为指导当地生产提供一定依据,通过常规病毒检测和分离方法,从2008年山东无名高热病猪送检样品肺部组织中检测并分离PRRSV.根据PRRSV美洲经典株VR-2332的ORF5基因设计特异引物,利用RT-PCR和基因克隆ORF5基因,分析其与国内外PRRSV毒株差异.经过细胞病变和间接免疫荧光检测证明所分离到的PRRSV是一山东地方流行毒株,命名为SD-4.通过分析ORF5基因序列及与其它毒株的比较,将北美洲株分为Ⅰ亚群和Ⅱ亚群.SD-4的核苷酸与Ⅰ亚群和Ⅱ亚群及欧洲毒株相比同源性分别为87.4 %～89.9 %,92.7 %～99.2 %和63.7 %～63.8 %.其氨基酸序列的同源性相比分别为85.1 %～91.0 %,90.5 %～99.5 %和56.7 %～57.7 %.进化树分析结果表明SD-4与高致病性毒株JXA1,HUB1,HEB1和SY0608的亲缘关系很近.PRRSV山东分离株SD-4属于美洲经典毒株,可能为高致病性PRRSV毒株.     

1株猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的遗传演化分析

将2008年云南某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征病例的病料处理后,接种Marc-145细胞,并对其进行病毒分离和鉴定,将分离株命名为Yunnan-08株.根据GenBank中PRRSV的基因序列进行设计.合成了针对ORF5和ORF7基因的引物,将RT-PCR扩增目的基因克隆入pGEM-Teasy载体中进行测序,再将测序结果提交给GenBank.应用DNAstar软件包分析,将该毒株的ORF5和ORF7基因序列及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株Lv、美洲型代表株VR2332和中国参考株CH-1a(AY032626)等毒株相应基因序列进行核苷酸比对,并与ATCC-VR2332(U87392)株、Lv(M96262)株等毒株进行氨基酸同源性比较,绘制系统的进化树,确定遗传演化关系.结果表明,该分离株的ORF7与VR2332的ORF7基因同源性为56.9%,与Lv株的ORF7基因同源性为41.7%;该分离株的ORF5与VR2332的ORF5基因同源性为87.1%,与Lv株的ORF5基因同源性为63.8%.表明新分离到的PRRSV Yunnan-08株仍属北美型,但存在很大变异,该分离株的ORF5与中国标准株CH-1a的ORF5基因同源性为93.4%,而ORF7与中国标准株CH-1a的ORF7基因同源性仅为56.6%.同一个毒株不同的开放阅读框架遗传演化的差异如此之大,这在以往未见报道,该病毒的变异为我国对该病的防控设置了障碍,毒株遗传监测显得十分重要.     

两株高致病性PRRSV河南分离株ORF5基因克隆及遗传变异分析

从河南信阳和新乡两地区猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc145细胞病变的病毒,命名为HN1和HN2。采用RT-PCR方法从分离的2株PRRSV中均分别扩增出ORF5基因,并将其克隆、测序。用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较,绘制系统进化树,结果表明,ORF 5核苷酸与北美洲型的同源性为81.2%～99.1%,与欧洲型Lv株的同源性分别为35.9%和35.3%,推导氨基酸与北美洲型的同源性为84.5%～99.5%,与欧洲型Lv株的同源性分别为46.0%和45.5%。证明新分离到的PRRSV毒株仍属北美洲型。与国内分离的高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB1、JX0612、GDZC1、ZQ、SX-1、HB1、HEB1、Hnyz核苷酸同源性达96.5%～99.1%,氨基酸同源性为96.0%～99.5%。分析结果表明,所获得的2个毒株GP5蛋白氨基酸序列中的抗原表位已经发生变异。     

2006年-2008年河南省PRRSV分子流行病学调查

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的NSP2,ORF5-7基因的核苷酸序列,设计合成5对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出10株PRRSV河南地方株的NSP2和ORF5-7片段,将扩增片段克隆到pMD-18T载体并进行测序。应用DNAStar序列分析软件对分离株的NSP2和ORF5-7基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的PRRS毒株进行了同源性比较,结果表明PRRSV河南分离株的NSP2和ORF5-7基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%-98.1%和81.4%-96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.7%-61.7%和44.7%-45.9%;同时将PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因的推导氨基酸序列与其他美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因发生了变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GS株结构蛋白基因的克隆及结构特征分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株基因序列设计合成了6对引物,应用RT-PCR方法对PRRSVGS株部分片段进行基因的扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行拼接,并与国内外分离毒株进行核苷酸以及推导氨基酸序列同源性比较.结果发现PRRSVGS毒株结构蛋白基因全长3819bp,包括ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个阅读框,分别编码GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白;与BJ-4、CH-1a、HB-2(sh)/2002和VR-2332美洲株等核苷酸的同源性在87.9%～97.1%,推导的氨基酸同源性在88.3%～97.1%;而与LV和Euro毒株的同源性差异显著,核苷酸同源性在56.0%～70.0%,氨基酸同源性在54.9%～77.6%.构建的系统发育树证明该毒株在基因型上属于美洲型.     

中国部分地区2005－2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

 【目的】为分析2005－2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律,查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005－2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型 PRRSV,ORF5基因全长均为603 bp,未发现有基因缺失或插入,编码约200个氨基酸,分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSV Nsp2基因全长为2 940 bp,21株PRRSV Nsp2基因全长为2 850 bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失,共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSV ORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析,系统进化关系显示,除B02-2005株可能与疫苗株有关外,多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近,不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析,发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群,以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的２亚群。进化关系表明PRRSV ORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异,不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析

采用RT—PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了0RF7基因片段。序列分析结果表明获得的0RF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91．3％,氨基酸同源性为92．6％;与我国最早的PRRSV分离株CH—la相比,核苷酸同源性为93．5％,氨基酸同源性为92．6％;与我国高致病性PRRSV毒株SD—ZQ的核苷酸同源性最高为98．1％,氨基酸只有两个不同,同源性为98．3％;与本省的Hn-1／06毒株的核苷酸同源性为97．3％,氨基酸同源性为97．5％;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85．4％,氨基酸同源性为88．6％;与欧洲型分离株LV株和N-34株0RF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41．1％和40％,氨基酸同源性为47．1％和47．6％。表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。     

猪繁殖与呼吸系统综合征病毒华南株GDgz 的分离鉴定及遗传进化分析

为了解华南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异特性,用Marc-145细胞从广东省疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪场采集的肺组织中分离得到1株PRRSV(命名为GDgz),该毒株能产生明显的细胞病变。全基因组进化分析和同源性比对分析结果显示,GDgz与中国高致病性毒株位于同一分支,与欧洲型毒株Lelystad-virus同源性最低、仅为60.3%,与美洲型经典毒株VR-2332的同源性为88.8%,与中国高致病性毒株JXA1和HuN4同源性为98.8% 和98.9%,与JXA1的疫苗株同源性为91.1%,与NADC30和NADC30-like毒株 CHsx1401和JL580同源性分别为84.5%、87.2%和83.6%。NSP2序列比对结果显示,GDgz在高变区存在30个不连续氨基酸缺失。GP5序列比对结果显示,GDgz在GP5抗原表位上有氨基酸突变,表明GDgz属于美洲型高致病性毒株传代致弱的疫苗株,且在抗原表位上有一定程度的突变。