花生过敏原初步分离纯化及紫外光谱分析

以新鲜花生仁为原料,采用丙酮和乙醚交替脱脂,PBS浸提、硫酸铵分级沉淀,再经过透析袋处理小分子蛋白和盐离子,获得的蛋白通过葡聚糖凝胶Sephadex G-100凝胶柱分离纯化,得到花生中的主要过敏原蛋白。结果表明:该花生过敏蛋白的得率为13.5%;SDS-PAGE电泳测得花生过敏蛋白的分子量大约为15 kD和60 kD;紫外分光光度检测显示在210 nm处有最大吸收峰,且峰型单一,结合光学特征分析表明花生过敏原蛋白结构中含有双键或三键结构。     

花生过敏原蛋白Ara h2的分离纯化研究

食物过敏是食品安全领域内比较突出的问题,花生因其高致敏性被列为八大致敏原之首。在花生致敏原中,Ara h2是主要致敏原。以Ara h2为研究对象,通过对花生脱脂,设置不同浸提液、pH、料液比、浸提时间的蛋白质浸提条件,透析分离纯化目标蛋白质,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对优化结果进行鉴定,正交试验确定最佳浸提工艺。结果表明:最佳浸提工艺参数为浸提时间90min、浸提pH值7.4、浸提料液比1∶8、浸提液Tris-HCl缓冲液。在此优化条件下目标蛋白质含量可达1.58mg·mL~(-1),浸提率可达47.8%。     

花生过敏原物质及其脱敏方法研究进展

花生是重要的食入性过敏原食物,花生中的过敏原会引起极其罕见的过敏症,严重时甚至会导致人死亡。主要论述花生导致机体过敏的机理、花生中的过敏原物质及其脱敏方法,对降低花生制品致敏性、提高花生制品的安全性有重要意义;同时还为扩大花生制品市场提供有效的途径。     

基于R5 ELISA和RP-HPLC法的小麦发芽过程中主要致敏蛋白含量变化

【目的】探索不同萌发状态小麦麸质蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等主要致敏蛋白含量的动态变化规律,以及醇溶蛋白、谷蛋白亚基的含量变化,为无麸质食品的研发和发芽小麦的利用提供科学依据。【方法】控制发芽条件获得7种不同萌发状态的小麦,采用SDS-PAGE分析不同萌发状态小麦醇溶蛋白（Gliadins）、谷蛋白（Glutenin）的亚基组成变化,通过R5 ELISA和RP-HPLC进一步测定小麦发芽过程中麸质蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白亚基的含量变化。【结果】以R5 ELISA法和RP-HPLC法两种方法可有效测定小麦中麸质蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白亚基的含量,发芽处理对上述过敏蛋白及亚基有不同程度的影响;麸质蛋白含量在发芽初期变化不大,后期显著减少;ω-醇溶蛋白相对含量变化不显著;α-/β-醇溶蛋白的相对含量在发芽过程中大幅度降低（从未处理小麦籽粒的41.85%降低到发芽处理后的31.51%—35.35%,P＜0.01）,γ-醇溶蛋白相对含量从31.37%显著增加到发芽处理后的36.69%—39.02%（P＜0.05）;高分子量麦谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（low molecular weight glutenin subunit,LMW-GS）的相对含量变化不显著,HMW-GS略有减少,从8.66%（未处理组）降低到5.94%（芽长1/4）,再回升到7.28%（芽长=籽粒长）;LMW-GS略有增加,从8.30%（未处理组）增加到10.45%（芽长=籽粒长）。【结论】R5 ELISA法和RP-HPLC法两种方法都可以有效进行小麦致敏蛋白定量分析;发芽过程中小麦的致敏蛋白含量总体呈下降趋势,特别是在发芽芽长达籽粒长1/2时,含有最多致敏肽的α-/β-醇溶蛋白下降尤为显著,提示小麦进行适度发芽处理可以降低致敏性。     

The Technology Research of Anti-oxidation Peptide Preparation by Alkaline Protease Hydrolyzing Wheat Germ Meal

小麦胚芽粕是小麦胚芽提油后的副产物,大部分未得到充分开发利用,因此有大量的小麦胚芽蛋白损失。为了充分开发利用小麦胚芽粕蛋白,对其进行了碱性蛋白酶酶解备抗氧化肽。通过单因素实验和回归分析,得到最优实验条件为加酶量0.8%（w/w）,料水比1：12.3,酶解时间2.1 h,此条件下得到 DPPH清除率为49.78%,水解度为22%,水解液中肽含量为1.9%（w/w）.通过SDS-PAGE电泳,肽的分子量都在10 ku以下,大部分在4.54和5.63 ku之间。小麦胚芽蛋白得到充分利用从而节约了粮食。     

中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽的研究

【目的】为了充分利用花生榨油之后的副产物,提高产品附加值,建立花生短肽制备工艺,研发功能性花生短肽产品。【方法】通过比较酶种类、底物浓度、酶解温度、酶解时间对水解度与短肽得率的影响,采用二次回归正交旋转组合设计优化分步酶解制备花生短肽的最佳工艺。【结果】中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备短肽的最佳工艺参数为：Neutrase水解花生分离蛋白2.04 h后加入Protamex继续酶解1.96 h,Neutrase添加量为5 200 U•g-1底物,Protamex添加量为422.32 U•g-1 底物,水解温度44.83℃,底物浓度8%,在此条件下,短肽得率为83.93%,水解度为38.25%,花生短肽纯度为93.85%±0.44%。经高效液相色谱测定,分子量小于1 000 D的水解产物占98.88%。【结论】采用Neutrase与Protamex分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽,与现有碱性蛋白酶酶解制备花生短肽方法相比,避免了后续脱盐步骤,简化了工艺,且具有制备条件温和,DH和TCA-NSI高,纯度高,分子量集中分布于1 000 D以下等特点。     

大豆抗原蛋白β-conglycinin线性表位及其不同种属动物过敏血清结合能力比较

试验通过生物信息学方法预测β-conglycinin线性表位,综合已发表文献筛选出四段具有代表性氨基酸序列合成短肽,采用ELISA和点杂交法检测表位肽段与仔猪、犊牛、兔三种不同种属动物过敏血清结合程度差异。结果表明:通过生物信息学方法预测合成的肽段均为β-conglycinin表位肽;三种动物过敏血清与四段表位肽结合能力存在显著差异,其中四段表位肽与仔猪、犊牛过敏血清结合能力显著高于兔过敏血清(P0.05);同一动物与四段不同肽段结合敏感程度差异显著(P0.05),兔过敏血清与肽段β1结合能力最强,仔猪过敏血清与α1肽段结合能力最强,犊牛过敏血清与肽段β2肽段结合能力最强。结果为寻找β-conglycinin最佳优势表位提供理论支持,同时为揭示大豆抗原蛋白种属间致敏差异机理奠定基础。     

经基因工程改造的花生主要过敏原Arah2制备及其低致敏原性鉴定

构建经基因工程改造的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性.将花生主要过敏原Arah2基因序列进行颠换,并将颠换后的序列进行合成,再将合成后的基因克隆到原核表达载体pET -32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;利用Isopropyl β-D -1 - Thiogalactopyrano...     

鸡蛋蛋白过敏综述

鸡蛋过敏是一种复杂的无序状态,许多鸡蛋蛋白均可引起过敏。鸡蛋蛋白过敏受多种免疫机制驱动,过敏发生率和占主导地位的过敏机制随年龄改变而改变。鸡蛋过敏一般为免疫球蛋白E(IgE)介导型过敏反应,鸡蛋蛋白中主要的过敏原为卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶。鸡蛋过敏真实患者或疑似患者及早避食蛋制品和及时给予喂养指导十分重要。通过对过敏的诱发和免疫机理的了解探讨了导致鸡蛋过敏反应的过敏原特征和检测手段,并对过敏反应的预防策略进行分析。     

乳酪蛋白肽制备工艺的优化

[目的]研究制备乳酪蛋白肽的最佳工艺.[方法]以乳酪蛋白为原料,以水解度为考察指标,确定碱性蛋白酶为乳酪蛋白的最佳水解酶.利用单因素试验考察酶解温度、pH、投酶量、酶解时间和底物浓度对水解度的影响,确定主要影响因素.通过L9(34)正交试验获得碱性蛋白酶的最佳水解条件.利用凝胶色谱法确定乳酪蛋白肽的分子量.[结果]试验得出制备乳酪蛋白肽的最佳工艺为:酶解温度60℃,pH 7.0,投酶量1.5％,酶解时间150 min.制备的乳酪蛋白肽分子量为2 kD.[结论]研究可为乳酪蛋白活性肽的产业化研发提供理论依据.     

鲤鱼胶原蛋白的过敏原性研究

以鲤鱼鱼皮为研究对象,通过碱溶、酸溶、NaCl盐析等方法从鱼皮中分离纯化得到了胶原蛋白.SDS-PAGE分析显示,鲤鱼胶原蛋白由分子质量约为120 ku和115 ku的2条α链（α1与α2）、分子质量约为250 ku的β链以及大分子质量的γ链组成.分析比较鲤鱼胶原蛋白与鲢鱼小清蛋白的基本性质,结果显示：2种蛋白质的pH值稳定性相似;胶原蛋白的热稳定性不如小清蛋白,但比小清蛋白更耐胃蛋白酶消化;在高温高压处理下,胶原蛋白明显降解,小清蛋白则出现了降解与聚合2种情况.应用8份鱼类过敏患者血清的酶联免疫吸附测定实验结果显示,小清蛋白对6份血清有特异性IgE反应,胶原蛋白对3份血清有特异性IgE反应.Dot-blot实验结果显示,胶原蛋白与鱼类过敏患者血清出现了特异性的杂交显色斑点.与小清蛋白相似,鲤鱼胶原蛋白具有特异的IgE结合活性,提示其是一种潜在的过敏原.     

大豆致敏蛋白脱敏方法研究进展

大豆是一种富含多种优质营养蛋白的主要生产原料,广泛应用于食品、饲料等领域,同时也含有能够引起过敏患者发生过敏反应的致敏蛋白,且含量较高,引起的过敏发病率在世界范围内逐年攀升,成为一个急需解决的生命健康问题。按照传统方法避免食用大豆产品并不可行,因此通过一定的脱敏方法降低大豆蛋白致敏性已成为研究热点。本文综述了大豆致敏蛋白的过敏机制、脱敏方法及低致敏性大豆制品的开发,并对其今后的研究方向做出了展望。     

绿豆萌发过程中蛋白组分及亚基变化

【目的】探索不同萌发时期绿豆分离蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量的动态变化规律,以及蛋白质组分（分离蛋白、球蛋白和清蛋白）的亚基组成及含量变化,为绿豆蛋白的加工利用提供科学依据。【方法】采用等电点沉淀法提取绿豆分离蛋白,并根据Osborne分类法制备绿豆清蛋白、谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白,比较分析萌发前后绿豆分离蛋白及各蛋白组分含量的变化,同时通过SDS-PAGE电泳进一步分析萌发前后蛋白亚基组成及数量的变化。【结果】随着萌发时间的延长,绿豆分离蛋白的含量呈现先增高后下降的趋势,萌发36 h时与未萌发的绿豆相比提高了9.4%。绿豆清蛋白含量随着萌发时间的延长呈逐渐下降的趋势,萌发84 h时含量最小,为20.47 mg·g^-1。球蛋白随着萌发时间的延长呈现先升高后下降的趋势,萌发48 h时其含量最大,且比未萌发时提高了3.47倍。萌发对绿豆醇溶蛋白的含量变化影响不大。绿豆谷蛋白含量在萌发12-36 h和48-72 h变化无明显差异,但相对于未萌发的绿豆仍有一定程度的提高。绿豆蛋白酶活性在萌发36 h后不断上升,变化相对较大,72 h时开始下降。SDS-PAGE电泳图及光密度扫描分析结果发现,绿豆分离蛋白主要由7条条带组成（Ⅰ-Ⅶ）,萌发过程中各条带相对含量不断减少,随着萌发时间的延长,分子量在25-66 kD的条带含量逐渐降低,分子量在18-25 kD的亚基条带含量在萌发的前72 h有所增加,萌发至96 h时几乎只剩下Ⅳ条带。绿豆清蛋白主要由4条条带组成（Ⅰ-Ⅳ）,分子量分别为61.56、48.99、29.88和20.42 kD,萌发过程中条带Ⅰ相对含量从0 h的18.4%降至60 h的16.4%,萌发72 h后条带Ⅰ消失;条带Ⅱ在萌发过程中始终存在,但是含量不断减少;条带Ⅲ和条带Ⅳ也在萌发过程中不断减少,萌发72 h后消失。同时,分子量为18-25 kD的亚基条带相对含量在24-60 h增加,萌发至72 h逐渐消失,几乎只剩下条带Ⅱ。绿豆球蛋白主要由5条条带组成（Ⅰ-Ⅴ）,分子量分别为66、61、50、32和26 kD。萌发过程中亚基条带Ⅰ和Ⅱ都在萌发96 h时消失;而条带Ⅲ在萌发过程前期（0-60 h）相对含量逐渐增大,为34.4%-41.8%,萌发72 h后条带Ⅲ含量迅速下降,萌发至96 h时仅为10.8%;亚基条带Ⅳ和Ⅴ萌发至84 h后消失。分子量在18-25 kD的亚基条带在萌发24-60 h时有所增加,随着萌发时间的延长,出现降解甚至消失。【结论】适当萌发能提高蛋白的含量,促进大分子亚基发生水解,同时有利于小分子亚基或多肽生成,但萌发时间过长并不完全利于蛋白的利用。     

Pen a1抗原表位187-202关键氨基酸的筛选和鉴定

【目的】Pen a1是虾中主要的过敏原蛋白,其抗原表位与致敏作用有关。对Pen a1的一个抗原表位187—202中氨基酸的出现频率及保守性进行分析后合成突变肽,并检测该突变肽与表位抗体的结合能力,筛选关键氨基酸,为研究虾致敏机理及脱敏方法提供理论依据。【方法】利用MEGA5软件对Pen a1蛋白5个表位及其氨基酸的组成与出现频率进行分析,选出这些表位中出现频率大的氨基酸;对过敏原数据库中所有致敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列的保守性进行分析,筛选出保守性高的氨基酸。两种方法筛选出的共有氨基酸为潜在的关键氨基酸。用丙氨酸分别替代这些潜在的氨基酸形成突变肽。利用固相合成法分别合成原表位肽及突变肽。并将原表位肽作为免疫原免疫新西兰大白兔,获得表位多克隆抗体。利用间接ELISA方法及竞争性Dot-blot方法检测突变的表位肽与表位抗体IgE结合能力,筛选出结合能力明显下降的突变肽,其中替换的氨基酸即为该表位的关键氨基酸。【结果】谷氨酸（E）、亮氨酸（L）、精氨酸（R）、谷氨酰胺（Q）、缬氨酸（V）、丝氨酸（S）、天冬氨酸（D）在表位中出现频率较大,并高于在Pen a1整体蛋白中出现的概率,为活性氨基酸。将序列在187—202的表位中氨基酸组成及出现频率进行统计,推测E、V、L可能为该表位的关键氨基酸。将SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白序列与Pen a1氨基酸序列用DNAMAN软件进行多序列比对,K、L、E、V、G在所有比对的序列中都存在,表明这5个氨基酸为保守氨基酸。选择共有的E、V、L为可能的关键氨基酸,用丙氨酸替代表位中E、V、L分别合成1、2和3号突变肽。用竞争性Dot-blot检测突变肽结合抗体能力,以提取纯化的虾致敏蛋白为包被原,用突变肽抑制虾蛋白结合抗体,发现原表位肽抑制作用明显,1号突变肽的抑制作用与原表位肽相似,2、3号肽的抑制作用明显低于原表位肽。谷氨酸突变的1号突变肽对表位活性并没有较大影响,说明谷氨酸不是该表位的关键氨基酸;而2、3号突变肽与抗体的结合能力明显降低,即亮氨酸和缬氨酸是该表位的关键氨基酸。同时,利用间接ELISA方法,将原表位肽和突变肽与兔血清反应,比较OD450值。结果显示,1号突变肽致敏性降低,OD450值约为对照的1/2.1,2号突变肽OD450值降低为对照的1/2.6,3号突变肽OD450值降低为对照的1/3.2。说明突变表位与表位抗体结合能力均有不同程度的降低。结合竞争Dot-blot试验结果,亮氨酸和缬氨酸为该抗原表位的关键氨基酸。【结论】建立了一种关键氨基酸的筛选和鉴定的方法。亮氨酸和缬氨酸被丙氨酸取代后,其与表位对应抗体的结合能力发生明显下降,是Pen a1中表位187—202的关键氨基酸。这种筛选关键氨基酸的方法可以用于其它抗原表位的关键氨基酸的确定及氨基酸对表位致敏性的影响,深入研究过敏原脱敏机理;同时也可用于基因工程或氨基酸修饰中降低过敏原致敏性。     

高效液相色谱联用四极杆轨道阱质谱分析柏树花粉过敏原蛋白

本研究采用高效液相色谱花粉中的蛋白,采用胰蛋白酶于37℃进行溶液酶切,肽段经过前处理和色谱分离后,采用复合四极杆轨道阱质谱进行分析,利用SDAP蛋白数据库和Proteome Discover 2.1软件鉴定分析其中过敏原蛋白。圆柏花粉中可检测到37种蛋白,其中有3种蛋白的特征肽段分别与柏科花粉1组和2组变应原具有较高的一致性。高效液相色谱复合四极杆轨道阱质谱联用技术能够获得柏树花粉中丰富的蛋白和肽段信息,灵敏度和分辨率较高,可用于花粉过敏原蛋白的鉴定和分析。     

碱性蛋白酶酶解小麦胚芽粕制备抗氧化肽技术研究(英文)

小麦胚芽粕是小麦胚芽提油后的副产物,大部分未得到充分开发利用,因此有大量的小麦胚芽蛋白损失。为了充分开发利用小麦胚芽粕蛋白,对其进行了碱性蛋白酶酶解备抗氧化肽。通过单因素实验和回归分析,得到最优实验条件为加酶量0.8%(w/w),料水比1:12.3,酶解时间2.1 h,此条件下得到DPPH清除率为49.78%,水解度为22%,水解液中肽含量为1.9%(w/w).通过SDS-PAGE电泳,肽的分子量都在10 ku以下,大部分在4.54和5.63ku之间。小麦胚芽蛋白得到充分利用从而节约了粮食。     

卵转铁蛋白间接竞争ELISA方法的建立

卵转铁蛋白是鸡蛋中的主要过敏原,针对鸡蛋中主要过敏原卵转铁蛋白建立了间接竞争ELISA方法,该方法检出限为(619.26±65.6)ng/m L。该方法对卵类黏蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白、牛奶总蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、花生总蛋白、大豆、杏仁和绿豆等致敏蛋白没有交叉反应。板内和板间重复性较好,因此所建立的方法可用于对卵转铁蛋白的检测。     

克氏原螯虾原肌球蛋白的纯化及过敏原性分析

以13份甲壳类动物过敏患者血清的Western—blotting分析,确定克氏原螯虾主要过敏原为36ku蛋白质．通过盐析、等电点沉淀及热处理等方法纯化该蛋白质,以兔抗拟穴青蟹原肌球蛋白（Tropo-myosin,TM）多克隆抗体的Western—blotting分析,确定该蛋白质为TM．同源性分析表明,克氏原螯虾TM与南美白对虾TM、拟穴青蟹的氨基酸序列相似性较高（〉90％）．酶切位点预测显示,它分别有49个胰蛋白酶和6个胰凝乳蛋白酶的酶切位点．模拟胃肠液消化实验结果显示,纯化TM不易被胃蛋白酶降解,易于被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解,进一步的Western—blotting和抑制性ELISA分析结果显示,其消化产物仍具有一定的免疫活性．采用蒸煮处理可降低TM的消化稳定性及免疫活性,且蒸煮处理时间越长,效果越显著．说明。TM为克氏原螯虾主要过敏原．与其他甲壳娄动物TM的序列相似件较高．     

溶质和硬质型桃果实成熟过程果肉多肽组学分析

【目的】 比较溶质型和硬质型桃在果实成熟过程中肽段和前体蛋白的差异,为挖掘决定或调控成熟过程的关键多肽提供理论依据。【方法】 通过多肽组学的方法,对溶质型（‘CN13’）和硬质型（‘CN16’）桃内源性多肽特征以及前体蛋白功能进行分析,对比两种肉质桃果实在成熟衰老过程中前体蛋白和多肽的相对含量,并对差异肽段前体蛋白进行富集分析。【结果】 本研究分别提取了‘CN13’和‘CN16’两个时期（S3和S4III）的内源性肽样品进行质谱检测,共鉴定到473个前体蛋白,包含特异性肽段序列2 580条。对肽段的分子量、等电点以及剪切位点进行归纳整理,并对内源性肽段所对应的高丰度前体蛋白进行COG功能注释和pathway富集分析,结果显示前体蛋白主要参与一般功能预测、翻译后修饰、蛋白质转换、能量产生和转换以及碳水化合物运输与代谢等过程。差异肽段前体蛋白的富集分析表明,‘CN13’在成熟过程中差异肽段前体蛋白与氧化还原、活性氧代谢和电子传递链等生物学过程相关,主要参与糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径和RNA转运等途径;而‘CN16’差异肽段前体蛋白是与金属离子反应、无机物反应和镉离子反应等生物学过程相关,主要参与多种环境下微生物新陈代谢、剪接体和RNA转运等途径;同处在S4III时期的‘CN16’和‘CN13’差异肽段前体蛋白与基因表达、翻译和细胞大分子生物学过程相关,主要参与RNA降解、RNA转运和剪接体等途径。【结论】 ‘CN13’和‘CN16’果实在成熟过程中多肽差异显著,差异肽段前体蛋白主要涉及淀粉/蔗糖代谢、糖酵解和核糖体合成等途径,暗示这些代谢途径与桃果实成熟衰老关系密切,为进一步挖掘调控桃果实成熟衰老过程的关键多肽提供了理论参考。     

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因表达条件的优化

将已构建并测序正确的含有牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的pGEX-4T—P23转化菌用IPTG进行诱导表达,经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为46．0ku的融合蛋白．根据SDS—PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件,结果显示诱导时机和时间是影响表达的主要因素,诱导温度和IPTG浓度次之;确定最佳诱导时机为转接种后2．0h,最佳诱导温度34℃,最佳诱导时间6．0h,最适IPTG浓度0．08mmol／L．表达产物主要以包涵体存在,在优化条件下融合蛋白的表达量经Bandscan5．0软件分析约占菌体总蛋白的31．7％．