脂质体法介导山羊精子转染外源DNA最适条件的研究

研究了阳离子脂质体介导山羊精子转染外源DNA的方法、效果及其影响因素以确定其最适转染条件,为进一步用此方法生产转基因动物提供参考.结果显示：①脂质体介导法可用于山羊精子转染外源DNA;②脂质体介导转染1、2、3号公羊的精子消化后阳性率分别为25.2%,22.6%,27.5%,差异不显著（p〉0.05）.③脂质体介导转染的精子消化前后阳性率在充分洗涤组为41.3%和25.5%,极显著高于原精液直接加入1∶10∶1转染液不洗涤处理组的25.6%和11.4%及原精液加入不含缓冲液的转染液处理组的17.2%和7.8%（p〈0.01）.④离心洗涤后精液分别与在转染缓冲液中加入0、0.1%、0.3%、0.6%BSA（质量/体积）的转染液共同孵育后的消化前后阳性率分别为41.3%和25.5%、35%和21.4%、27.5%和15.3%及11.2%和8.2%;⑤用不同缓冲液配制的转染液进行脂质体介导山羊精子转染外源DNA的效率有差异,其中以mDM液转染精子的消化前、后阳性率最高（为41.3%和25.5%）.研究表明：脂质体介导转染外源DNA的独特机制使供精个体间精子转染效率趋于一致;精子与脂质体-DNA复合物混合前将精子充分离心洗涤可显著提高脂质体介导精子转染外源DNA的效率;血清白蛋白能降低脂质体对精子介导的转染效率;脂质体法介导山羊转染外源DNA的最适转染条件为用mDM液充分洗涤精子后再与脂质体-DNA复合物混合转染.     

脂质体介导外源基因体外转染山羊精子的研究

实验以山羊精子为对象,研究脂质体介导精子转染外源基因的效率和对生产阳性胚胎的影响.山羊鲜精离心洗涤除去精浆,分别用地高锌(DIG)末端标记的线形外源DNA与精子直接共育(对照组),阳离子脂质体LipofectamineTM-DNA复合体与精子共育(实验组),用免疫组化的方法分别检测它们的转染效率;用成熟卵母细胞与转染外源DNA并已获能的精子行体外受精,PCR方法检测生产阳性胚胎的效率.结果发现添加阳离子脂质体对提高山羊精子结合外源DNA和生产阳性胚胎的效率不显著(p＞0.05),对照组和实验组阳性精子率、DNase I消化后内化率与胚胎PCR阳性率分别为(47.56±3.09)%和(42.54±6.08)%、(26.67±2.40)%和(24.33±2.67)%、24.24%和22.73%,同时还发现添加阳离子脂质体对山羊精子活力和体外受精能力影响不显著(p＞0.05).

Abstract：

The potential use of liposome in sperm cells as vectors to transfer exogenous DNA via the fertilization of oocytes into the germ line of goat (Capra hircus) was evaluated. Seminal ejaculates collected artificially from healthy adult bucks were pooled together and the washed sperm were incubated with exogenous DIG-labeled linear DNA for 60 min (control group, CG), or with LipofectamineTM-DNA complex (treatment group, TG). The transfection rate of sperm was observed by the in situ hybridization methods. The in virto produced embryos were screened by PCR assay. The results showed that the improvement efficiency of sperm transfection with exogenous DNA by the addition of cationic liposome was nonsignificant, statistically, the positive sperm rate, internalization rate after DNase I treatment and PCR-positive rate of the embryo of CG and TG being (47.56±3.09) % and (42.54±6.08) %, (26.67±2.40) %and (24.33±2.67)% and 24.24% and 22.73%, respectively. The sperm motility and the fertilization rate were not significantly different between CG and TG (P＞0.05), suggesting that DNA transfer into goat sperm was not enhanced very efficiently in the presence of liposome.     

脂质体介导FecB基因转染太行山羊精子的研究

以太行山羊为研究对象,探索精子作为外源基因载体建立转FecB目的基因山羊的可行性,以及脂质体对转染效率的影响.采用共培养与阳离子脂质体介导2种方法转染精子,用原位杂交等技术检测FecB目的基因片段在精子中的存在及存在部位,并对2种方法进行分析.结果表明:太行山羊的精子具有主动捕获外源基因的能力,共培养法精子阳性率为18...     

山羊精子介导转染外源DNA的研究

目的：建立山羊精子介导转染外源DNA的方法,并探索精液离心与否与添加异种精清对转染效率的影响.方法：将采集的山羊精液经过离心处理与标记的线形化pEGFP-N1质粒共育转染,分别用免疫组化的方法检测转染效率、PCR和Southern blotting检测转染外源DNA在精子的结合部位和结合率;同时将实验分为3组,分别为鲜精直接转染、离心后转染和离心山羊精液添加猪精清转染,用免疫组化方法检测转染外源DNA效率.结果：精子核后帽区是结合转染外源DNA的主要部位;3种处理的阳性转染率分别为（26.19±3.25）%、（62.04±7.87）%和（17.04±9.34）%;DNaseⅠ消化后的阳性转染率分别为（11.50±5.05）%、（34.00±5.87）%和（10.00±4.24）%.离心组与未离心组和添加猪精清组差异极显著（p〈0.01）.结论：山羊精子具有自发性结合外源DNA的能力;羊精清和异种精清明显降低精子结合外源基因的效率.     

山羊精子介导转染外源DNA的研究

目的:建立山羊精子介导转染外源DNA的方法,并探索精液离心与否与添加异种精清对转染效率的影响.方法:将采集的山羊精液经过离心处理与标记的线形化pEGFP-N1质粒共育转染,分别用免疫组化的方法检测转染效率、PCR和Southern blotting检测转染外源DNA在精子的结合部位和结合率;同时将实验分为3组,分别为鲜精直接转染、离心后转染和离心山羊精液添加猪精清转染,用免疫组化方法检测转染外源DNA效率.结果:精子核后帽区是结合转染外源DNA的主要部位;3种处理的阳性转染率分别为(26.19±3.25)%、(62.04±7.87)%和(17.04±9.34)%;DNaseⅠ消化后的阳性转染率分别为(11.50±5.05)%、(34.00±5.87)%和(10.00±4.24)%.离心组与未离心组和添加猪精清组差异极显著(p＜0.01).结论:山羊精子具有自发性结合外源DNA的能力;羊精清和异种精清明显降低精子结合外源基因的效率.     

不同处理对山羊精子转染外源DNA效率的影响

将采集的山羊精液去除精清,分为鲜精组、冻精组、反复冻融致死组3组进行处理后,与地高辛标记的线性化PCS2EGFP质粒共育转染,用免疫组化的方法检测精子转染外源DNA的效率.结果显示鲜精、冻精和反复冻融致死3种处理组的阳性转染效率分别为(36.61±7.91)%,(32.68±3.38)%,(69.36±4.79)%.反复冻融致死组转染率极显著高于鲜精组和冻精组(p＜0.01),鲜精组和冻精组转染效率差异不显著(p＞0.05).

Abstract：

Goat semen was centrifuged and divided into three groups:fresh sperm, frozen-thawed sperm and dead sperm by repeated frozen-thawed treatment. The sperms were incubated in vitro with foreign DIG-labeled linear PCS2EGFP plasmid. The transfection rates of the sperms were determined immunohistochemically. The results showed that the sperm DNA-binding rates were (36.61±7.91)%, (32. 68±3.38)%and (69. 36±4.79)%, respectively, for the above-mentioned three groups, and the sperm DNA-binding rate of dead sperms with repeated frozen-thawed treatment was significantly higher than that of the other two groups (p＜0.01).     

荧光原位PCR定位动物精子介导转移的外源基因

用荧光原位PCR对经体外介导外源基因转移方法处理的家畜精子进行检测。结果证实,牛,山羊和绵羊的精子在一定条件下能够携带所转移的外源基因,其平均转移效率分别为：绵羊27.12%,牛31.16%,山羊30.57%,同时发现外源基因已进入精子细胞内并位于核及其外围区域。     

脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究

采用Lipofectin阳离子脂质体介导质粒DNA转染藏鸡成纤维细胞,通过优化重组质粒转染细胞的各种参数以寻求最佳的转染条件。结果表明:6孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时,用2μL脂质体介导1.5μg重组质粒转染10 h即可获得较满意的转染效率。说明Lipofectin能有效介导质粒pEGFP-N3转染藏鸡成纤维细胞,转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。     

精子介导生产转hCD59基因猪

为研究精子介导法生产异种器官移植用转基因猪的效率,将人膜反应性溶解抑制物(hCD59)基因与脂质体混合制成基因/脂质体复合物,分别采用睾丸注射法和基因脂质体复合物/精子共孵育法制备转人hCD59基因猪,其中睾丸注射法处理公猪1头,44 d后配母猪8头,7头受孕(受孕率87.5%),产仔73头,PCR阳性猪3头(阳性率4.3%);外源基因/精子共孵育法处理公猪4头,处理母猪4头,1头受孕(受孕率25%),产仔11头,PCR阳性猪1头(阳性率9%)。从15头受孕母猪共获得84只仔猪,经PCR初步检测,其中4只仔猪为转基因阳性,阳性率4.8%。研究结果表明:通过精子介导法可以获得转基因猪。     

脂质体LTX介导高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)条件的优化

探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、质粒DNA用量、脂质体与质粒DNA比例、脂质体-DNA复合物与细胞作用时间进行优化,荧光显微镜下统计转染后24h的转染效率。结果显示：在24孔培养板中,每孔接种细胞6×104个,24h后进行转染,质粒DNA每孔0.6μg,脂质体与质粒DNA比例为4.5：1.0,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6 h时,转染效率最高,达到81.2％。     

重组Tgo DNA聚合酶最适扩增条件的研究

以重组TgoDNA聚合酶为研究对象,检测了其最适扩增条件。结果表明:该重组酶的最适pH为8.75,最适Mg2 浓度为2.0 mmol/L,最适延伸温度为71.9℃。利用该重组酶成功扩增了质粒pUC19、野大麦Na /H 逆向运转蛋白基因、拟南芥Timeless基因、小鼠Cx37基因和人CYT2C9基因。     

山羊RAPD反应条件的研究

以贵州山羊为材料,研究了MgCl2浓度,引物浓度,d.NTP浓度,模板DNA用量,TaqDNA聚合酶用量对RAPD反应的影响,建立了一套适合山羊的最佳RAPD反应体系。反应总何种为25μl,MgCl2浓度2.0mmol/L,引物为18.75ng,dNTP浓度0.32mmol/L,模板DNA为15ng.TaqDNA聚合酶为2U,PCR反应程序为：94℃ 3min.38℃ 1min.72℃ 2min,40Cycles;72℃ 10min。     

木聚糖酶最适反应条件的研究

通过单因素试验设计和均匀试验设计试验,确定了木聚糖酶反应的最适条件。结果表明：木聚糖酶活性测定的最佳条件是温度为50℃、pH值为4．0—6．0,温度和pH值是木聚糖酶活性测定结果的主要影响因素。     

金银花中主要内含物最佳浸提条件研究

[目的]为了确定金银花的最适浸提条件,为加工金银花饮料提供参考。[方法]通过花水比、温度、时间三因素二水平正交试验,测定水浸出物、氨基酸、黄酮和绿原酸含量并分析其变化情况。[结果]金银花中水浸出物的最适浸提条件为:花水比1∶40,温度80℃,时间20 min,水浸出物含量为45.96%;金银花中绿原酸的最适浸提条件为:花水比1∶40,温度80℃,时间15 min,绿原酸含量为4.09%;金银花中氨基酸的最适浸提条件为:花水比1∶30,温度70℃,时间10 min,氨基酸含量为2.02%;金银花中黄酮的最适浸提条件为:花水比1∶40,温度80℃,时间15 min,黄酮含量为0.826 2%。[结论]金银花的最适浸提条件是花水比1∶30~1∶40,温度70~80℃,时间10~15min。     

茶薪菇产纤维素酶最佳液体发酵条件的研究

[目的]研究茶薪菇产纤维素酶的最佳液体培养条件。[方法]以茶薪菇为材料,探讨碳源、氮源、初始pH值、温度、转速和培养时间对茶薪菇产纤维素酶的影响,确定最佳发酵条件。[结果]麸皮为碳源时,茶薪菇产纤维素酶活力最高,葡萄糖为碳源时产酶活力较低。(NH4)2SO4为氮源时,茶薪菇产纤维素酶活力最高,其次是酵母粉与蛋白胨。茶薪菇在pH值6.0时产酶活力最高。28℃以下时茶薪菇生长较缓慢,32℃以上时菌丝生长较快,但酶活力较低,30℃时产酶活力最高。转速180 r/min、培养时间5 d时茶薪菇产酶活力最高。[结论]茶薪菇产纤维素酶的最佳液体培养条件为麸皮5%,(NH4)2SO41%,初始pH值6.0,培养温度30℃,转速180 r/min,培养时间5 d,此条件下,纤维素酶活力达40.2 U/ml。     

精子介导的转基因效率关键影响因素

【目的】精子介导的转基因技术简单易行,其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同。但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低,转基因效率差异极大。现将主要探讨导致这种现象的原因。【方法】小鼠精子获能后分别与0、15、30和300nmol·L^-1 的Cy-3标记DNA（Cy-3-DNA）在37℃共孵育30 min。其后,血细胞计数板检测小鼠精子的活率;共孵育精子进行直接涂片,DPBS洗涤后涂片,DnaseI消化后涂片,精子涂片置于荧光显微镜下,记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数,用于统计精子结合及内化DNA的效率。精子与300 nmol·L^-1 的Cy-3-DNA共孵育后,以50µmol·L^-1的 P₄诱导精子顶体反应,统计顶体反应前后显示Cy-3信号的精子比例。精子分别与15和300 nmol·L^-1 Cy-3-DNA共孵育后,精子进行体外受精,在荧光镜下观察合子期受精卵中Cy-3-DNA的存在位置。按照优化后的条件,精子分别与0、15和300 nmol·L^-1 pEGFP-C1质粒共孵育后进行体外受精,制备转基因胚胎。比较试验组和对照组的受精率和发育效率,采用PCR和RT-PCR方法检测囊胚期外源基因整合和表达情况。【结果】获能后的精子分别与0、3、15、30和300 nmol·L^-1的Cy-3-DNA共孵育后,精子的活率分别为82.21%、73.63%、77.38%、76.33%和77.80%;洗涤前精子结合DNA的效率分别为76%、94%、99%、100%,15、30和300 nmol·L^-1组精子结合率均显著高于3 nmol·L^-1组（P＜0.05）。洗涤后精子结合DNA的效率,分别为45%、66%、84%和87%,消化后精子内化DNA的效率分别为44%、56%、71%和76%,并且洗涤后精子结合及消化后精子内化DNA的效率都为300 nmol·L^-1组和30 nmol·L^-1组均显著高于其他两组,而15 nmol·L^-1组显著高于3 nmol·L^-1组（P＜0.05）;Image J对精子结合Cy-3-DNA的强度进行分析的结果表明,外源DNA的量随着外源DNA浓度的增加而显著增加（P＜0.01）。顶体反应后,精子顶体部DNA会有丢失,但精子头部后区的外源DNA依然会保留,因此,顶体反应前后,精子结合外源DNA的精子比率没有降低。15和300 nmol·L^-1 DNA共孵育的精子体外受精后,荧光显微镜下检测显示,合子期胚胎有外源DNA的荧光信号分布,将荧光信号在雄原核附近密集的胚胎记为阳性胚胎,300 nmol·L^-1 DNA共孵育的精子获得合子期胚胎的阳性率为27.89%,显著高于15 nmol·L^-1组的9.00%（P＜0.05）。精子与pEGFP-C1质粒共孵育后,体外受精,结果表明精子与DNA共孵育后,卵母细胞受精率及胚胎卵发育率与对照组相比差异不显著。单囊胚PCR检测15和300 nmol·L^-1的pEGFP-C1质粒与精子共孵育转基因胚胎阳性率分别为8.72%和21.50%;采用RT-PCR方法在300 nmol·L^-1组的囊胚中检测到了EGFP基因 RNA的表达,在荧光显微镜下没有观察到EGFP绿色荧光蛋白的表达。【结论】精子具备结合和内化外源DNA的能力,并能将外源DNA带入卵母细胞,顶体反应会使精子丢失顶体部DNA,但精子头部后区外源DNA依然保留。受精过程外源DNA在基因组中的整合及外源基因表达激活是精子介导转基因效率的关键影响因素。     

红叶石楠叶片原生质体分离条件的研究

以红叶石楠(Photinia×frasery)叶片为试验材料,研究了预处理时间、酶类组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量及酶解温度等不同因素对其原生质体分离的影响。结果表明,以1.0%的纤维素酶+0.3%的果胶酶为混合酶液,11%的甘露醇为渗透压稳定剂,在25℃±1℃的条件下,酶解8h,获得的原生质体产量最高,可达14.7×106个/g(FW),原生质体活力可达84.5%。